人角质形成细胞的分离培养

实验材料：

1. 早产儿或死亡胎儿的皮肤，也可用手术取下的成体皮肤

2. 1000000U/L中性蛋白酶，0.25%胰蛋白酶

3. MEM和HBSS混合液，添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L链霉素和1.5g/L庆大霉素

4. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊

5. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 取厚1.5mm的皮片，用4℃MEM和HBSS混合液冲洗获取的皮肤材料3次。将皮肤置于培养皿中，用镊子和眼科剪仔细分离皮肤和皮下组织，去除脂肪和疏松结缔组织。

2. 将皮肤展评，用手术刀切成2-3mm2的小片，放入中性蛋白酶消化液中，4℃下消化15-20h，或37℃下消化2-4h。

3. 用无菌针头和眼科镊子分离真皮与表皮。表皮薄而透明，真皮厚且轻微肿胀的凝胶状。

4. 将分离出的表皮块用0.25%胰蛋白酶，在37℃下振荡消化10-20min后，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。

5. 1500r/min分离心5min，吸去上清液，用培养液重新悬浮沉淀细胞，用吸管轻轻吹散细胞，细胞计数。

6. 调整细胞密度至1.5×105个/ml，植于塑料培养皿培养，也可与滋养层细胞共同培养。当细胞生长覆盖至培养皿底壁面积的70%-80%时，可进行传代培养。