材料与仪器
D-PBSA 0.17%胰蛋白酶 PET
转运培养液 生长培养液 含抗菌素的生长培养液 手术刀和11号刀片 眼科剪 眼科镊2把 50mm或100mm培养级Petri培养皿 35mm和100mm非培养级Petri培养皿 15ml锥形离心管 微量加液器 涂有FN C BSA的50mm培养皿
转运培养液 生长培养液 含抗菌素的生长培养液 手术刀和11号刀片 眼科剪 眼科镊2把 50mm或100mm培养级Petri培养皿 35mm和100mm非培养级Petri培养皿 15ml锥形离心管 微量加液器 涂有FN C BSA的50mm培养皿
步骤
一、原代培养
1. 取手术切除或早期活检组织，将组织放入转运培养液（Leibowitz L-15培养液，添加 100 μg/ml 庆大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 1μg/ml两性霉素B），尽快送到实验室。
2. 将组织移入 100 mm 培养皿，用 P-PBSA （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco PBSA）浸洗。
3. 尽量切除结缔组织和有血液部分。如果组织标本的表面面积 ≥1 cm2，将其切成小块。
4. 将组织块放入 35 mm 培养皿，然后加入足够 0.17 % 胰蛋白酶液（用 P-PBSA 配制），覆盖组织块。在 4°C 条件下孵育过夜。
5. 用一把镊固定组织块，用另一把镊将上皮剥离入胰蛋白酶液。
6. 将组织悬液轻轻研磨几次，使细胞进一步分散。然后，将细胞悬液移入离心管。
7. 用 D-PBSA 浸洗培养皿，然后将浸洗液加入细胞悬液。浸洗用量同步骤 4 组织消化的胰蛋白酶液。
8. 用微吸管吸取一等份测定细胞产量。
9. 在4°C 条件下离心（125 g），最好用制冷离心机。用生长培养液混悬细胞。
10. 按要求用含抗菌索的生长培养液（生长培养液添加 100 μg/ml 庆大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 1 μg/ml 两性霉素B）稀释细胞悬液，然后将细胞接种于涂有 FN/C/BSA 的 50 mm 培养皿，密度为 5×103 个/cm2。
11. 24 h 后换培养液，以除去细胞碎片和红细胞。
12. 隔天换液。
二、传代培养
13. 用 D-PBSA 浸洗细胞。
14. 加入 PET 液（含有 1 % 聚乙烯吡咯酮（PVP，40 KDa）、0.5 mmol/L EGTA 和 0.025 % 胰蛋白酶，用 D-PBSA 配制），完全覆盖细胞，如在 100 mm 培养皿加入3 ml。
15. 在室温下孵育，直至细胞变圆或从培养皿去附着。在显微镜下观察细胞去附着情况，此过程一般需要 1.5 min。可通过加入高浓度胰蛋白酶或在 37°C 条件下消化提高去附着效率。
16. 当大多数细胞去附着时，轻弹培养皿和用胰蛋白酶液吹打细胞，以机械性地加强去附着。
17. 细胞去附着后，向培养皿加入 5~10 ml D-PBSA，终止胰蛋白酶的消化。
18. 将细胞悬液注入离心管，轻轻研磨，以使细胞充分混悬。
19. 用 1 ml 吸管取细胞悬液，加入血细胞计数板，计数细胞。
20. 计算悬液中细胞密度。
21. 在 4°C 条件下离心（125 g，5 min）。
22. 吸去上清液，用手指轻弹离心管，直至沉下的细胞分散。
23. 加入适量生长培养液，用吸管轻轻混悬细胞，然后将细胞悬液注入培养皿。
24. 将全部培养皿放入浅盘内，用手移动浅盘，并变化移动方向，从而摇动培养皿。注意保证每个培养皿中的细胞密度均匀，即摇动培养皿时集中于培养皿中心。另外，应注意将放培养皿的架平坦固定于孵育箱，孵育箱不能振动，以免细胞在贴壁过程中分布不均匀。
25. 将细胞静置孵育 4~24 h，然后换培养液。
1. 取手术切除或早期活检组织，将组织放入转运培养液（Leibowitz L-15培养液，添加 100 μg/ml 庆大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 1μg/ml两性霉素B），尽快送到实验室。
2. 将组织移入 100 mm 培养皿，用 P-PBSA （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco PBSA）浸洗。
3. 尽量切除结缔组织和有血液部分。如果组织标本的表面面积 ≥1 cm2，将其切成小块。
4. 将组织块放入 35 mm 培养皿，然后加入足够 0.17 % 胰蛋白酶液（用 P-PBSA 配制），覆盖组织块。在 4°C 条件下孵育过夜。
5. 用一把镊固定组织块，用另一把镊将上皮剥离入胰蛋白酶液。
6. 将组织悬液轻轻研磨几次，使细胞进一步分散。然后，将细胞悬液移入离心管。
7. 用 D-PBSA 浸洗培养皿，然后将浸洗液加入细胞悬液。浸洗用量同步骤 4 组织消化的胰蛋白酶液。
8. 用微吸管吸取一等份测定细胞产量。
9. 在4°C 条件下离心（125 g），最好用制冷离心机。用生长培养液混悬细胞。
10. 按要求用含抗菌索的生长培养液（生长培养液添加 100 μg/ml 庆大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 1 μg/ml 两性霉素B）稀释细胞悬液，然后将细胞接种于涂有 FN/C/BSA 的 50 mm 培养皿，密度为 5×103 个/cm2。
11. 24 h 后换培养液，以除去细胞碎片和红细胞。
12. 隔天换液。
二、传代培养
13. 用 D-PBSA 浸洗细胞。
14. 加入 PET 液（含有 1 % 聚乙烯吡咯酮（PVP，40 KDa）、0.5 mmol/L EGTA 和 0.025 % 胰蛋白酶，用 D-PBSA 配制），完全覆盖细胞，如在 100 mm 培养皿加入3 ml。
15. 在室温下孵育，直至细胞变圆或从培养皿去附着。在显微镜下观察细胞去附着情况，此过程一般需要 1.5 min。可通过加入高浓度胰蛋白酶或在 37°C 条件下消化提高去附着效率。
16. 当大多数细胞去附着时，轻弹培养皿和用胰蛋白酶液吹打细胞，以机械性地加强去附着。
17. 细胞去附着后，向培养皿加入 5~10 ml D-PBSA，终止胰蛋白酶的消化。
18. 将细胞悬液注入离心管，轻轻研磨，以使细胞充分混悬。
19. 用 1 ml 吸管取细胞悬液，加入血细胞计数板，计数细胞。
20. 计算悬液中细胞密度。
21. 在 4°C 条件下离心（125 g，5 min）。
22. 吸去上清液，用手指轻弹离心管，直至沉下的细胞分散。
23. 加入适量生长培养液，用吸管轻轻混悬细胞，然后将细胞悬液注入培养皿。
24. 将全部培养皿放入浅盘内，用手移动浅盘，并变化移动方向，从而摇动培养皿。注意保证每个培养皿中的细胞密度均匀，即摇动培养皿时集中于培养皿中心。另外，应注意将放培养皿的架平坦固定于孵育箱，孵育箱不能振动，以免细胞在贴壁过程中分布不均匀。
25. 将细胞静置孵育 4~24 h，然后换培养液。
来源：丁香实验
