脂肪酶测定的几个问题

问：我是做脂肪酶克隆表达的。现在已经将目的基因整合到毕赤酵母GS115中，可是几番诱导下来，就是没有酶活。现在小弟想请教各位战友几个脂肪酶活性检测的问题，怕是表达出来，因为检测方法有误。

1、诱导培养基BMMY的磷酸缓冲液浓度为100mmol/L，请问这个浓度是不是太高？如果脂肪酶表达量很低的话，测定过程中产生的游离脂肪酸也很少。如果活性测定的磷酸缓冲液浓度太高的话，会不会影响测定结果，也就是说将酶活掩盖？

2、在测完酶活后，发现三角烧瓶壁上粘附着一些乳化油。需要用很浓的氢氧化钠才能清洗掉。请问这是不是说明我的乳化工作做的不好。可是我的乳化液配好了放在冰箱4度保存刚一个周啊？

3、菌液在离心时，我是用5000（4度）离心10分钟的。如果有表达的话，这个转速不应该把蛋白离下去吧？

我的脂肪酸测定流程：

一：微波溶解4％的聚乙烯醇

二：聚乙烯醇跟橄榄油混合

三：上述乳化液4ml与25mmol的磷酸缓冲液（5ml）混合，50度保温5min

四：加入1ml上清，反应20min

五：加入15ml95％乙醇终止

六：立刻滴定（50mmol的氢氧化钠）

请各位战友看看这个流程有没有问题，谢谢！

答：乳化液要现配的，PVA与橄榄油比为2：1 ，还有你的缓冲液的PH值，50度是不是太高了点，有没有用破乳剂呀？

答：我们这也是做脂肪酶的，我们做过乳化液要现配。破乳剂就是用10ML30%的氯化钠，你可以试试。还有就是反应的最适PH，你也可以做几个不同的温度、PH看看。