PCR-SSO标本基因组DNA提取

由于DNA分型技术以PCR扩增为基础，对待测标本DNA的量要求不高，下面介绍的是采用微量全血法提取标本DNA，也可以采用其他类型的样本和其他方法提取DNA，但提取DNA的OD260/280比值范围应该为1.8～2.0。

（一）基因组DNA提取

[试剂配制和仪器要求]

（1）EDTA或枸橼酸钠抗凝全血约0.5ml

（2）红细胞裂解液:（0.32mol/L 蔗糖，1%（v/v）TritonX-100，5mmol/L MgCl2，12mmol/L Tris-HClpH7.5）

（3）白细胞裂解液：pH8.0,10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1% SDS。

（4）蛋白酶K

（5）8mol/L的醋酸钾

（6）氯仿

（7）无水乙醇及70%乙醇

（8）高速离心机及离心管

（9）加样器及吸头

[操作步骤]

（1）取1.5ml离心管，加入500ul新鲜或冻存全血（用EDTA或枸橼酸钠抗凝，不要用肝素抗凝，因为肝素抑制Taq多聚酶的活性），与红细胞裂解液或双蒸水1ml，颠倒数次混匀；

（2）3000rpm离心2分钟，弃上清；

（3）加入红细胞裂解液或双蒸水1ml，进一步裂解红细胞，离心弃上清，直到红细胞完全裂解；

（4）裂解白细胞：加400ul细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K（终浓度为100ug/ml），置65℃水浴消化2小时或过夜；

（5）蛋白处理：加75ul 8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750ul氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清（水相）移至一新的Eppendorf管中，弃有机相；

（6）沉淀DNA：于上清液中加入750ul无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；

（7）洗涤DNA（洗去DNA中的盐）：加1ml70%乙醇,混匀，10000r/min离心5min,去上清；

（8）溶解DNA：让离心管中的液体挥发后（注意不要使DNA过于干燥），根据DAN沉淀的大小，加一定量的蒸馏水，37℃溶解。如果DNA不能完全溶解（溶液中折光率不均匀，可见粘稠状物质），可将溶液加热至94℃，作用2分钟；

（二）提取DNA质量和浓度的检测

将待测DNA样品用蒸馏水1：50稀释，即10ulDNA加上490ul蒸馏水，测定其OD260/280比值，判断样品DNA的纯度；测定样品DNA的OD260值，通过下列公式计算样品DNA的浓度：

样品DNA浓度（ug/ul）=OD260×2.5