原理
本试剂盒采用独特的两相分离技术，结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DN的目的。适合从5 ml 的抗凝人或哺乳动物全血，或500 ul 抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至250 ug 的基因组DNA。
材料与仪器
抗凝全血
血基因组DNA大量试剂盒
DNA 制备管 中量滤器 连接管
血基因组DNA大量试剂盒
DNA 制备管 中量滤器 连接管
步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
1. 说明书，耗材：DNA 制备管、中量滤器、连接管。
2. Buffer VL：细胞和病毒裂解液，室温密闭贮存。
3. Buffer G-B：蛋白沉淀液，室温密闭贮存。
4. Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液。请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。
5. Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。
6. Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。
7. Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
8. Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
9. Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
二、实验准备
1. 第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。
3. 制备Buffer DV：取4 ml Buffer DV-A 250 ml 异丙醇，150 ml 异丁醇，加入提供的500 ml 试剂瓶中，混合均匀。
4. 4℃预冷Buffer DV。
三、实验步骤
【DNA 释放 】
【DNA 释放 】
1. 将5 ml 抗凝全血置于一50 ml 离心管中，若全血样本体积不足5 ml，用PBS 补充至5 ml。
2. 加入10 ml Buffer VL，盖紧离心管帽，旋涡振荡1 min。
3. 加入10 ml Buffer G-B，再次盖紧离心管帽，立刻上下混匀。
【两相分离去除蛋白和其它杂质】
4. 加入20 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合均匀。≥5 000xg 离心5 min。
~undefined 请在实验前按照第一页准备Buffer DV。
5. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入20 ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，≥5 000xg离心5min。
【基因组DNA 的纯化】
6. 丢弃上相，将下相转移至中量滤器中（滤器置于另一50 ml 离心管中），将活塞插入注射器，缓慢推动活塞，收集50 ml 离心管中的滤液。
~undefined 上相必须完全弃尽。
7. 弃滤器，在滤液中加入10 ml Buffer BV，混合均匀。
8. 将DNA 大量制备管插到负压装置的插口上，将步骤7 的混合液移到制备管中，开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱。
9. 待步骤8 管中液体都吸尽后，加入15 ml Buffer W1，吸尽管中液体，保持负压。
10. 加入20 ml 已加入乙醇的Buffer W2，吸尽管中液体，关闭负压装置。
~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
11. 将大量制备管从负压装置转移至另一洁净的50 ml 离心管中，≥6 000xg 离心5 min。
12. 将大量制备管插回到负压装置的插口上，保持负压5 min，吸尽残存的Buffer W2。
13. 将大量制备管置于另一洁净的50 ml 离心管中，在silica 膜中央加1.5 ml Eluent 或去离子水，室温静置5 min，≥6 000xg 离心5 min 洗脱DNA。
~undefined 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
14. 可选步骤：同样方法，在silica 膜中央加0.75 ml Eluent 或去离子水，室温静置1 min，≥6 000xg 离心5 min 洗脱DNA。
注意事项
1. 下列操作步骤适合从5 ml 的抗凝人或哺乳动物全血，或500 ul 抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至250ug 的基因组DNA。
2. Buffer VL，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水和生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
3. 在按照此说明书操作前，请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作，按照正确方法处理体液和感染体。
4. 操作时严格按操作步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，并高压灭菌。
来源：丁香实验
