原理
本试剂盒采用独特的两相分离技术，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到纯化基因组DNA的目的。适合从3 ml的抗凝人或哺乳动物全血获得100 ug的基因组DNA，抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至120 ug的基因组DNA。
材料与仪器
抗凝全血
血基因组DNA中量试剂盒
中量制备管 中量滤器 连接管 塑料扳手 中量管盖
血基因组DNA中量试剂盒
中量制备管 中量滤器 连接管 塑料扳手 中量管盖
步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
说明书，耗材：中量制备管、中量滤器、连接管、塑料扳手、中量管盖。
Buffer VL：细胞和病毒裂解液，室温密闭贮存。
Buffer G-B：蛋白沉淀液，室温密闭贮存。
Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。
Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。
Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
二、实验准备
1. 第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。
3. 制备Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A 125 ml 异丙醇，75 ml 异丁醇，加入提供的250 ml 试剂瓶中，混合均匀。
4. 4℃预冷Buffer DV。
三、操作步骤
【DNA 释放 】
1. 将3 ml 抗凝全血加入一50 ml 离心管中，若全血样本体积不足3 ml，用PBS 补充至3 ml。
2. 加入6 ml Buffer VL，盖紧离心管帽，旋涡振荡1 min。
2. 加入6 ml Buffer VL，盖紧离心管帽，旋涡振荡1 min。
3. 加入6 ml Buffer G-B，再次盖紧离心管帽，立刻上下混匀。
【两相分离去除蛋白和其它杂质】
4. 加入12 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合均匀。≥5 000xg 离心5 min。
~undefined 请在实验前按实验准备中提供的方法准备Buffer DV。
5. 尽可能吸尽蓝色上相，保留相间沉淀和下相。加入12 ml，4℃预冷Buffer DV，用力混合，≥5 000xg 离心5 min。
【基因组DNA 的纯化】
6. 丢弃上相，将下相转移至中量滤器中（滤器置于另一50 ml 离心管中），将活塞插入注射器，缓慢推动活塞，收集50 ml 离心管中的滤液。
~undefined 上相必须完全弃尽。
~undefined 如在转移过程中下相没有任何界面沉淀，步骤6 可以省略。
7. 弃滤器，在滤液中加入6 ml Buffer BV，混合均匀。
8. 将连结管插到负压装置的插口上，再将DNA 中量制备管插到连结管上。将步骤7 的混合液移到制备管中，开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱，吸尽管中液体。
9. 保持负压，加入8 ml Buffer W1，吸尽管中液体。
10. 保持负压，加入9 ml 已加入乙醇的Buffer W2，吸尽管中液体。
~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
11. 用塑料扳手将中量制备管中的DNA 结合部分从负压装置转移至另一洁净的1.5 ml 离心管中，加入0.3 ml Buffer W2，盖上中量制备管盖后，12 000xg 离心2 min。
12. 将DNA 结合部分置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加0.5 ml Eluent 或去离子水，盖上中量制备管盖后，室温静置2 min，12 000xg 离心1 min 洗脱DNA。
~undefined 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
13. 可选步骤：同样方法，在silica 膜中央加0.25 ml Eluent 或去离子水，盖上中量制备管盖后，室温静置1 min，12 000xg 离心1 min 洗脱DNA。
注意事项
1. Buffer VL，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水和生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2. 在按照此说明书操作前，请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作，按照正确方法处理体液和感染源。
3. 操作时严格按操作步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，并高压灭菌。
来源：丁香实验
