血基因组DNA 试剂盒提取法

一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 

1.  说明书，耗材：96孔深孔板（1.6 ml），96圆孔板，96孔DNA制备板，96圆孔硅胶片，BF-400膜。
 

2.  Proteinase K：冻干的蛋白酶K 可室温贮存6 个月，长时间保存请置于4℃；溶解后，在2-8℃可贮存2 个月，长时间保存请勿置于室温中。
 

3.  Buffer PK ：蛋白酶K 溶解液，室温密闭贮存。
 

4.  Buffer BL ：细胞裂解液，室温密闭贮存。
 

5.  Buffer W1B concentrate ：洗涤液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

6.  Buffer W2 concentrate ：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

7.  10xBuffer W2（12x96 试剂盒）：用于配制Buffer W2 。
 

8.  Eluent B：7.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.3 mM EDTA ，室温密闭贮存。
 

二、实验准备
 

1.  第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
 

2.  Buffer W2（12x96 试剂盒）配制：在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10xBuffer W2，135 ml 去离子水和350 ml 乙醇，可用100%无水乙醇或95%乙醇。
 

3. 根据瓶上标签将蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中，请勿旋涡振荡。
 

4. 准备70℃温浴。
 

5. 使用前检查Buffer BL 是否有沉淀析出，若出现沉淀，请于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。
 

三、操作步骤
 

1.  向96 圆孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶K。
 

2.  加200 ul 抗凝全血到96 圆孔板中。
 

~undefined 若全血样品体积少于200 ul，用PBS 补充到200 ul。

~undefined 若样品为鸟类血，样品用量须低于10 ul。

~undefined 若需得到RNA-free 的基因组DNA，在步骤3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
 

3.  加200 ul Buffer BL ，注意不要打湿每孔的边缘，用96 圆孔硅胶片密封各孔。
 

4.  用力混合30 s。
 

5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机，当速度达到3000rpm后即停止。
 

6. 在培养箱或烘箱中70℃温浴至少10 min。
 

7.  3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机，当速度达到3 000rpm后即停止。
 

8. 取下96 圆孔硅胶片，每孔加入200 ul 乙醇（96-100%）。
 

9.  用96 圆孔硅胶片密封各孔，用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机，当速度达到3 000 rpm 后即停止。
 

10.  将96 孔DNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片，将每孔中的溶液转移至96 孔DNA 板 中，6 000 rpm 离心4 min。
 

11.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液，将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入500 ul Buffer W1B，用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 离心4 min。
 

~undefined 确认在Buffer W1B concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

12.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液，将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入850 ul Buffer W2，用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm 离心4 min。
 

~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

13.  弃滤液，将96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入400 ul Buffer W2， 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 离心4 min。
 

14.  将96孔DNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm离心15 min。
 

15.  将96孔DNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入100-200 ul Eluent B 或去离子水，室温静置2 min，用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板，6 000 rpm 离心4min洗脱得到DNA。
 

 1.  Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水和生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。