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PCR-SSO预杂交和杂交

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2350
PCR-SSO 预杂交和杂交
 
【材料和试剂】
(1)         50 X Denhardt:2.5g聚蔗糖400,2.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),2.5g牛血清白蛋白(BSA),加蒸馏水250ml。
(2)         预杂交液:5XSSPE,5Xdenhardt液,0.5%SDS,100ug/ml变性并裂解的鲑精DNA。
(3)         50%甲酰胺
(4)         10 X SSPE(p H 7.4):100mmol/L NaH2PO4,1.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA。
(5)         固定有样本DNA的尼龙膜
(6)         标记的SSO探针
(7)         杂交炉或杂交袋
(8)         恒温水浴摇床(80rpm,有盖,温度可调至65℃)
(9)         精确温度计(精度为±0.1℃)
(10)      可调加样器(1~20ul,20~200ul,200~1000ul)
 
【操作步骤】
预杂交和杂交可以在杂交炉或杂交袋中进行。
(1)         将固定有样本DNA的尼龙膜用2XSSPE浸润后放入杂交管或杂交袋中,有重叠时应用专用筛网隔开;
(2)         加入预杂交液:用杂交袋时,按每平方厘米0.2ml计算;用杂交管时,加入的杂交液以旋转时杂交管中的尼龙膜被覆盖为准。注意不能有气泡存在于液体之中;
(3)         42℃预杂交10分钟至1小时;
(4)         取出杂交袋或杂交管,在上述预杂交液中加入标记的SSO探针进行杂交,加入探针量为1ul/ml(预)杂交液;
(5)         42℃杂交1小时至过夜。
 
【注意事项】
(1)         如果杂交液中不含甲酰胺,杂交应在68℃进行,此时杂交较为严格。
(2)         在预杂交和杂交过程中,尼龙膜接触(或覆盖)的杂交液中应该无气泡。
(3)         放射性物质的操作应严格遵守有关规定和采取适当的防护措施。
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