科学家们在 CRISPR/Cas 的重要研究成果

基因编辑技术 CRISPR/Cas9 被《科学》杂志列为 2013 年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。小编梳理了一下科学家们在 CRISPR/Cas 方面的研究，分享给大家。

Adv Mater：新型纳米颗粒更高效地将 CRISPR 基因编辑工具递送到细胞中

在一项新的研究中，来自中国科学院和美国塔夫茨大学的研究人员开发出一种在肝脏中显著改善的递送 CRISPR/Cas9 基因编辑工具的方法。这种递送方法使用生物可降解的合成脂质纳米颗粒，将这些基因编辑工具递送到细胞中，精确地改变细胞的遗传密码，效率高达 90%。根据这些研究人员的说法，这些纳米颗粒是迄今为止报道的最有效的 CRISPR/Cas9 递送工具之一，并且可能有助于克服技术障碍，使得基因编辑在一系列临床治疗应用中得以实现。

相关研究结果近期发表在 Advanced Materials 期刊上，论文标题为 「Fast and Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing In Vivo Enabled by Bioreducible Lipid and Messenger RNA Nanoparticles」。

这项研究中描述的脂质纳米颗粒包埋编码 Cas9 的信使 RNA（mRNA）。一旦这些包含 sgRNA 的纳米颗粒的内含物释放到细胞中，细胞中的蛋白制造工厂接管这种 mRNA 模板，并利用这种模板表达 Cas9 蛋白，从而实现这种基因编辑工具的作用。这些纳米颗粒的一种独特特征在于它们是由脂肪链中含有二硫键的合成脂质制成。当这些纳米颗粒进入细胞中时，细胞中的环境破坏了二硫键而将它们拆解开，从而导致它们中的内含物快速高效地释放到细胞中。

原文检索：doi:10.1002 /adma.201902575

Nat Biotechnol：开发出靶向能力和编辑效率得到改善的碱基编辑器

在一项新的研究中，来自美国布罗德研究所、哈佛大学和波士顿儿童医院的研究人员利用一种称为 「噬菌体辅助的碱基编辑器连续进化（phage assisted continuous evolution of base editors, BE-PACE）」 的系统开发出一种改进碱基编辑器的编辑效率的新方法。相关研究结果于 2019 年 7 月 22 日在线在 Nature Biotechnology 期刊上，论文标题为 「Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity」。在这篇论文中，他们描述他们的新系统及其作用机制。

这些研究人员开发出一种称为 BE-PACE 的系统，它可用于改进胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。他们利用他们的系统进化出一种称为 evoAPOBEC1 -BE4max 的 CBE。他们报道他们的测试表明它对胞嘧啶（在 GC 序列中）进行编辑的效率是现有系统的 26 倍，即便它对所有其他的测试序列中的胞嘧啶进行编辑时，也仍然保持较高的编辑效率。他们进一步报道对一种经过进化的称为 evoFERNY 的脱氨酶的测试结果表明它比 APOBEC1 小 29%。

这些研究人员指出，限制其他 CBE 的编辑效率的因素之一是 APOBEC1 对天然序列的偏好性，这导致 GC 基序发生较差的脱氨作用。为了克服这个问题，他们使用了 PACE 系统，这是因为它们能够在一天内进行多代选择、突变和复制。他们的目标是构建出具有改善的靶向能力的碱基编辑器。他们报道，他们开发的 BE-PACE 系统在过夜的宿主细胞培养物中以几乎十倍的噬菌体增殖速率进行了测试，而且它们展示出对携带碱基编辑器的噬菌体的选择性提高了 1000 倍。

原文检索：doi:10.1038 /s41587 - 019 - 0193 - 0

Nat Biotechnol：新研究拓宽碱基编辑器的靶向范围

碱基编辑要求靶序列满足 Cas9 结构域的前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）需求，并且靶核苷酸位于碱基编辑器的编辑窗口内。在一项新的研究中，为了增加碱基编辑器的靶向范围，来自美国布罗德研究所、哈佛大学和加州大学伯克利分校的研究人员设计出六种优化的腺嘌呤碱基编辑器（ABEmax 变体），它们使用与非 NGG PAM（non-NGG protospacer adjacent motif）相容的 SpCas9 变体。相关研究结果近期发表在 Nature Biotechnology 期刊上，论文标题为 「Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors」。

为了增加非 NGG PAM 中可修饰的靶碱基的范围，这些研究人员使用环状排列的 Cas9 变体产生了 4 种胞嘧啶碱基编辑器和 4 种腺嘌呤碱基编辑器，编辑窗口从大约 4～5 个核苷酸扩展到高达大约 8～9 个核苷酸，并且这会减少副产物的形成。

总之，这组碱基编辑器改善了胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑的靶向范围，这就为碱基编辑技术的更广泛应用提供了一种强有力的工具。

原文检索：doi:10.1038 /s41587 - 019 - 0134 -y

Nat Biotechnol：我国科学家开发出一种新型 RNA 编辑系统，编辑效率最高可达 80%

如今，在一项新的研究中，中国北京大学魏文胜（Wensheng Wei）课题组描述了一种使用内源性 ADAR 进行 RNA 编辑的替代方法。他们证实表达招募 ADAR 的 RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA），能够实现对内源性 RNA 进行高效而又精确的编辑，并且成功地校正致病性突变。相关研究结果于 2019 年 7 月 15 日在线发表在 Nature Biotechnology 期刊上，论文标题为 「Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs」。

魏文胜课题组将这种方法称为 LEAPER（leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA, 利用内源性 ADAR 对 RNA 进行可编程编辑）。具体而言，LEAPER 利用经过改造的 arRNA 招募天然的 ADAR1 或 ADAR2 酶，从而将特定的腺苷转变为肌苷。

他们发现由质粒或病毒载体或者作为合成寡核苷酸递送的 arRNA 都可实现较高的编辑效率，最高可达 80%。LEAPER 是高度特异性的，具有极低的全局性脱靶编辑率，而且在靶区域中对除腺苷之外的碱基进行有限的编辑。

此外，魏文胜课题组发现 LEAPER 在包括多种人原代细胞在内的很多细胞类型中具有活性，并且能够在源自赫尔勒综合征（Hurler syndrome）患者的原代成纤维细胞中恢复 α-L - 艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase）的催化活性，而不会引起先天性免疫反应。

原文检索：doi:10.1038 /s41587 - 019 - 0178 -z

Science：基因编辑大牛张锋开发出 RESCUE 技术，可扩大 RNA 编辑能力

基于 CRISPR 的工具彻底改变了我们靶向与疾病相关的基因突变的能力。CRISPR 技术包括一系列不断增长的能够操纵基因及其表达的工具，包括利用酶 Cas9 和 Cas12 靶向 DNA，利用酶 Cas13 靶向 RNA。这一系列工具提供了处理突变的不同策略。鉴于 RNA 寿命相对较短，靶向 RNA 中与疾病相关的突变可避免基因组发生永久性变化。此外，使用 CRISPR/Cas9 介导的编辑难以对诸如神经元之类的某些细胞类型进行编辑，因而需要开发新策略来治疗影响大脑的破坏性疾病。

在一项新的研究中，美国麻省理工学院麦戈文脑科学硏究所研究员、布罗德研究所核心成员张锋及其团队如今开发出一种称为 RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange, C→U 交换特异性的 RNA 编辑）的策略。相关研究结果于 2019 年 7 月 11 日在线发表在 Science 期刊上，论文标题为 「A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing」。

RESCUE 显著地扩展了 CRISPR 工具能够靶向的范围，包括蛋白中可修饰的位点，比如磷酸化位点。这些位点充当蛋白活性的开启 / 关闭开关，而且主要存在于信号分子和癌症相关通路中。

原文检索：doi:10.1126 /science.aax7063

Mol Cell：剪刀卡住了 —— 细菌使用 CRISPR/Cas9 的另一种方式

埃默里大学医学院 (Emory University School of Medicine) 和马克斯普朗克病原体科学研究所 (Max Planck Unit for the Science ofPathogens) 的科学家发现，CRISPR/Cas9 的 " 剪刀" 成分有时会卡住。Cas9 是一种切割 DNA 的酶，它也可以在不进行任何切割的情况下阻止基因活动。在新凶手弗朗西丝氏菌（Francisella novicida）中，Cas9 调控需要关闭的基因，使细菌致病。研究结果近日发表在《Molecular Cell》杂志上。

埃默里大学的微生物学家 David Weiss 博士和他的同事们几年前在寻找调节诺新凶手弗朗西丝氏菌毒性的基因时，已经发现了 Cas9。novicida 是引起 tularemia 的细菌的近亲，它生长在哺乳动物细胞内。为了阐明 Cas9 对毒性的重要性，他的实验室与德国 Emmanuelle Charpentier 博士领导的研究人员进行了合作。

研究人员发现，在 F. novicida 中，Cas9 只调控 4 个基因，所有这些基因都必须关闭，这样细菌才能致病。在其 DNA 剪子 / 噬菌体防御作用中，Cas9 是由一个互补于目标的 RNA 引导的。当 Cas9 作用于阻断基因活性时，Cas9 使用不同的 RNA 引导序列，由于长度较短，不允许剪子剪切。在其他类型的细菌中，Cas9 似乎对致病能力也很重要。

原文检索：doi:10.1016 /j.molcel.2019.05.029

Nat Med：重大进展！等位基因特异性基因编辑有望治疗遗传性耳聋

在一项新的研究中，来自美国哈佛医学院和波士顿儿童医院的研究人员利用一种新的基因编辑方法挽救了患有遗传性听力丧失的小鼠的听力，而且在成功地做到这一点的同时没有产生任何明显的脱靶效应。这些被称为贝多芬小鼠（Beethoven mice）的动物因为具有相同的导致人类进行性听力丧失（progressive hearing loss）并且最终在 20 岁左右耳聋的基因突变而接受了这种方法的治疗。相关研究结果于 2019 年 7 月 3 日在线发表在 Nature Medicine 期刊上，论文标题为 「Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss」。

这种新的方法涉及经典的 CRISPR-Cas9 基因编辑系统的一种优化的更加精确的版本，能够更好地识别在贝多芬小鼠中发现的这种引起疾病的基因突变。这种精确的工具允许科学家们选择性地让一个称为 Tmc1 的听力基因的缺陷拷贝失活，同时让它的健康拷贝发挥功能。值得注意的是，这些研究人员报道，他们的系统成功地在小鼠基因组的 30 亿个碱基中识别出 Tmc1 基因缺陷拷贝中单个错误的 DNA 碱基。

这些研究人员提醒说，即使是像这样的高精度基因编辑疗法在可用于人体之前，还有许多研究工作要做。不过，他们说，这项研究代表了一个里程碑，这是因为它极大地提高了标准基因编辑技术的功效和安全性。

哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所转化医学科学教授 David Corey 说道，「我们的研究结果证实目前经典的 CRISPR/Cas9 编辑工具的这种更精确、靶向性更好的版本实现了前所未有的识别水平和准确性。」

原文检索：doi:10.1038 /s41591 - 019 - 0500 - 9