细胞活性氧（ROS）检测

活性氧检测 (Reactive Oxygen Species Assay) 是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。

DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF。检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）是超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等总称，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程，与多种神经退行性疾病相关，如阿兹海默症、帕金森症等，通过检测 ROS 水平，可以评估疾病模型是否建立成功，亦可作为药效评价指标。

1、ROS 试剂盒：DCFH-DA9 (10 mM)、活性氧阳性对照（Rosup，50 mg/ml）；
2、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜；
3、PBS 试剂；
4、DMEM；

1、装载探针
对于刺激时间较短（通常为 2 h 以内）的细胞，建议先装载探针，后用活性氧阳性对照刺激细胞；对于需要较长时间刺激（通常为 6 h 以上）的细胞，建议先用活性氧阳性对照刺激细胞，后装载探针。

A. 原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。

1）按照 1:1000 用无 DMEM 稀释 DCFH-DA，使终浓度为 10 μm/L；

2）去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为宜；

3）37℃ 细胞培养箱内孵育 20 分钟。用 PBS 液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA；

4）阳性对照组，加入活性氧阳性对照，20-30 分钟后可以显著提高活性氧水平；

B. 收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

1）按照 1:1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为 10 μm/L；

2）细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为一百10¹⁰-10¹¹ 细胞/ml；

3）37℃ 细胞培养箱内孵育 20 分钟。每隔 3-5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触；

4)）用 PBS 液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA；

5）阳性对照组，加入活性氧阳性对照，20-30 分钟后可以显著提高活性氧水平；

2. 检测
对于原位装载探针的样品可以用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜直接观察拍照；

对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，亦可用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜直接观察拍照；

3. 参数设置
使用 488 nm 激发波长，525 nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF；

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高；

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好；

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间 (刺激时间除外)，以减少各种可能的误差；

4、实验试剂具有一定毒性，操作时穿好实验服并戴一次性手套操作；

1、阳性对照组荧光过弱：若在刺激后 30 min 内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度；

2、阳性对照组荧光过强：若活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度；

3、背景高：探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针；