流式细胞术检测 ROS 常见问答

1、现在做肿瘤细胞内 ROS 水平测定，使用流式细胞仪测 DCF 荧光强度，应该用什么做对照呢？

【问题】就是这种肿瘤细胞的正常细胞做对照吗？可不可以用任意的正常组织细胞做对照呢？或者只用 PBS 加 DCFH-DA 作为空白对照呢？

【回答】据经验，DCFH-DA 本身没有荧光，可穿过细胞膜进入细胞，在胞内转化生成 DCFH。

在活性氧作用下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF，荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。

如果要测定细胞内活性氧水平，做的是流式细胞检测。建议设立 2 组，疾病和正常组，其中各有一个对照：组内的对照是为了排除自发荧光的影响，设置疾病组和正常组是为了比较 ROS 水平是否显著改变。

肿瘤细胞+DCFH-DA 和肿瘤细胞+等量 PBS 为一组

正常细胞+DCFH-DA 和正常细胞+等量 PBS为一组

顺便提一下，最好用相同类型正常细胞做对照，因为不同类型细胞间的 ROS 水平本身就存在差异。

如果单纯检测细胞活性氧的基值，这个很难定义应该用什么细胞做对照，肿瘤细胞在永生化后与原正常细胞或是永生化前已经发生了改变，它并不能反应机体内肿瘤组织的肿瘤细胞的水平，所以与正常细胞比没有什么意义。

所以，这种测基值的实验基本没有什么意义。也不用讨论对照是什么了。

其实，针对培养细胞，测活性氧最常用的就是用药物刺激细胞，再比较刺激前后的活性氧变化，这时，对照显而易见就用非刺激的细胞。

2、现在用 DCFH-DA 标记检测 PC12 细胞内的 ros，但是为什么出现双峰呢？

【提问】如题

【回答】当然是双峰了，DCFH-DA 进入细胞内被 ros 分解后才的物质才能发出荧光的，没被分解的那部分自然落在阴性去了。