ROS流式检测QA

1、现在做肿瘤细胞内ROS水平测定，使用流式细胞仪测DCF荧光强度，应该用什么做对照呢？就是这种肿瘤细胞的正常细胞做对照吗？可不可以用任意的正常组织细胞做对照呢？或者只用PBS加DCFH-DA作为空白对照呢？

据经验，DCFH-DA本身没有荧光，可穿过细胞膜进入细胞，在胞内转化生成DCFH。在活性氧作用下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。你是要测定细胞内活性氧水平，做的是流式细胞检测。建议你设立2组，疾病和正常组，其中各有一个对照：组内的对照是为了排除自发荧光的影响，设置疾病组和正常组是为了比较ROS水平是否显著改变。

肿瘤细胞+DCFH-DA 和 肿瘤细胞+等量PBS 为一组

正常细胞+DCFH-DA 和 正常细胞+等量PBS为一组

顺便提一下，最好用相同类型正常细胞做对照！因为不同类型细胞间的ROS水平本身就存在差异。

首先要搞清楚你要做什么? 再讨论对照是什么的问题。

如果单纯检测细胞活性氧的基值，这个很难定义应该用什么细胞做对照，肿瘤细胞在永生化后与原正常细胞或是永生化前已经发生了改变，它并不能反应机体内肿瘤组织的肿瘤细胞的水平，所以与正常细胞比没有什么意义。所以，这种测基值的实验基本没有什么意义。也不用讨论对照是什么了。

其实，针对培养细胞，测活性氧最常用的就是用药物刺激细胞，再比较刺激前后的活性氧变化，这时，对照显而易见就用非刺激的细胞。

2、现在用DCFH-DA标记检测PC12细胞内的ros，但是为什么出现双峰呢？请各位不吝赐教

当然是双峰了，DCFH-DA进入细胞内被ros分解后才的物质才能发出荧光的，没被分解的那部分自然落在阴性去了。