ROS的检测方法

【求助】关于ROS的检测方法，谢谢

参与者：llemontree

ROS的检测方法都有哪些呢？比如HVA assay，luminol-enhanced chemiluminescence 方法等等，都有什么区别呢？谢谢

参与者：lwjssry

ROS的测定方法

细胞内ROS的检测可用DCF法[1，3，6][步骤参考6]

细胞外可用ROS试剂盒[4，5]，步骤按说明书进行。

以下是其他信息和文献：

key words：

关键词：二氯荧光素/

（1） ； ；EPR法：election paramagnetic resonance（EPR，电子顺磁共振谱）

Detection of ROS（活性氧类物质/活性氧）by election paramagnetic resonance（EPR，电子顺磁共振谱）（胰腺组织的ROS生成）。

（2） ； ；DCF法： dichlorofluorescein （DCF）二氯荧光黄[1，8，13]

活性氧检测试剂盒是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。活性氧检测试剂盒[9]。荧光法检测线粒体产生和释放的反应性氧化物（ROS）[10]。

羟基自由基的检测（二羟苄胺DHBAs和水杨酸盐Salicylate）[11] ROS was evaluated by the staining of 2’，7’- dichlorofluorescein diacetate（二氯荧光乙酰乙酸盐）.ROS production was detected by nitroblue tetrazolium （NBT，硝基四氮唑蓝）assay[2]。目前，对于细胞线粒体产生的ROS 测定，所发展的方法有（荧光标记后）激光扫描共聚焦显微术（Takahashi et al.，2002）和荧光探剂DCFDA标记后的荧光分光光度法（Esposti ，2002）等，本实验以lucigenin 或luminol 为探剂，用化学发光技术，对从正常大鼠肝细胞及心肌细胞分离的线粒体的METC 电子漏进行了测定[3]。美国人利用此方法定量测定组织和线粒体的活性氧的论文[13]。

（3） ； ；流式[7，12]：

要检测细胞内的活性氧，看了国内外的文献，发现用流式是一个较经典的方法[7].流式检测细胞内的活性氧[12]

（4） ； ；MCLA发光法：

DCFH方法的确是测定总活性氧状况，如果要单独测定超氧阴离子，可以用MCLA发光法[14]

（5） ； ；组织中：双氢罗丹明（DHR）（sigma，美国）可自由进出细胞膜，进入细胞后可被，-.氧化为可发出荧光的罗丹明-123，经过一定时间的积累，即可通过流式细胞仪检出相应的荧光[4]。血清中： ROS测定采用及griess试剂显色原理测定，试剂购自南京建成公司[4]。Fenton反应活性氧（ROS）试剂盒（南京建成生物工程研究所）[5]

（6） ； ；MDA（丙二醛）含量采用硫代巴比妥酸法（thiobarbituric acid reaction，TBA法）（南京建成生物工程研究所生产试剂盒）。MDA是评价人体氧化应激最常用的指标。Assays for markers of oxidative stress and lipid peroxidation were determined by TBA assay，and ROS were determined by DCF assay[1].The levels of lipid peroxidation in plasma and tissue homogenate were measured as TBARS using the LPO-test （Wako Pure Chemical Industries）[2].we measured the production of thiobarbituric acid-reactive substances （TBARS）in brown adipose tissues of diabetic mice at the end of FA feeding experiment.

（7） ； ；8-isoprostane（异构前列腺素/异前列腺素/异前列烷）： a marker of oxidative stress.是近年来发现的一组脂质过氧化产物，是提示机体氧化应激的可靠标志。Urinary 8-epi-PGF2 was determined using an enzyme immunoassay kit （Assay Designs Inc.）[2].

（8） ； ；SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法； 邻苯三氯自氧化法（SOD试剂盒，四川省医学试剂研究开发中心，Cu-Zn SOD南京建成生物工程研究所生产试剂盒）。Cu，Zn-Superoxide dismutase and Mn-superoxide dismutase activities were measured by using a water-soluble formazan dye kit.SOD activity was measured using the BIOXYTECH SOD-525 kit （Oxis International）[2].

（9） ； ；CAT：过硼酸钠作底物滴定法，南京建成生物工程研究所生产试剂盒

（10） ； ；GSH-Px，南京建成生物工程研究所生产试剂盒。

（11） ； ；GSH：

1） ； ；DTNB法定量测定

2） ； ；HPLC[13]

（12） ； ；GSSG：HPLC[13]

（13） ； ；GAPDH was measured by spectrophotometry（分光光度法）.

（14） ； ；.过氧化氢： Hydrogen peroxide concentration in plasma was measured using an Amplex Red hydrogen peroxide assay kit （Invitrogen Corp.）[2].H2O2 released from the tissue was detected using the Amplex Red hydrogen peroxide assay kit （Invitrogen Corp.）[2].以过氧化物酶荧光法检测癌细胞自发的过氧化氢生成量[15]

（15） ； ；自由基的检测方法很多，目前主要有ESR，HPLC，化学发光法以及分光光度法，我看了一点文献，我困惑的是，我要测定细胞中的超氧阴离子和羟自由基，我想用荧光分光光度法或者化学发光法，可是我发现一些反应体系要在酸性条件下反应（比如有的里面就有硫酸）。

这对于细胞应该有损伤啊~还有怎样处理细胞~希望对于自由基检测有经验的战友多多指导，也希望希望做自由基检测的新手一起交流.有国外文献提到，DCFH容易自氧化，不稳定，还有正象你文献所说一样，DCFH所反映的是线粒体内活性氧产生的总体状况，如果想要研究特异性的活性氧，如超氧阴离子或者羟自由基，应该选用那种方法，还有，用DCFH好象只能定性吧，怎样可以定量呢?[12]

（16） ； ；O2-、HO2-、•；OH、1O2、H2O2、LO•；、LOO•；、LOOH等含有氧的活性物质都具有较氧活泼的化学性质，统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS）

部分参考文献：

1． Stentz FB，Umpierrez GE，Cuervo R，Kitabchi AE.Proinflammatory cytokines，markers of cardiovascular risks，oxidative stress，and lipid peroxidation in patients with hyperglycemic crises.Diabetes.2004 Aug；53：2079-86.

2 Furukawa S，Fujita T，Shimabukuro M，Iwaki M，Yamada Y，Nakajima Y，Nakayama O，Makishima M，Matsuda M，Shimomura I.Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.J Clin Invest.2004 Dec；114（12）：1752-61.

3 周智波　钟丽君　程　时。线粒体电子传递链电子漏的化学发光测定。动物学报，　50 （1）：120 - 125 ，2004

4 黄学文，赵琪，陈道桢，张丽珊.肝癌患者血清及组织中ROS水平的测定.检验医学2004年第19卷第5期

5 周四桂，徐立朋，廖端芳，雷小勇，严奉祥，朱炳阳.环孢霉素A通过ROS-Cyclophilin A-ERK1/2信号途径抑制人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞粘附.生理学报

6 张荣芳，陈锋，朱茂祥，杨陡华.烹调油烟冷凝物对细胞的氧化损伤研究.中国公共卫生2004年3月第20卷第3期

7http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=2009324&sty=3&keywords=%BB%EE%D0%D4%D1%F5+%BC%EC%B2%E2

8 聂金雷，时庆德，张勇，李晓明，刘树森。利用荧光探针直接测定线粒体活性氧的形成。中国应用生理学杂志，2002

9 http://www.beyotime.com/ros-assaykit.htm

10 http://gotofcm.com/web2004v2/techinfoview.asp?id=269

11 http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100235/articlelist.asp?id=1863

12 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=2007992&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#2007992

13 J .B E J M A ，P .RAMIRES and L .L .J I，Free radical generation and oxidative stress with ageing and exercise： Differential effects in the myocardium and liver Acta Physiol Scand 2000，169，343±351

14 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=2096833&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#2096833

15http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=751869&sty=3&keywords=%BB%EE%D0%D4%D1%F5+%BC%EC%B2%E2