同时检测四色荧光蛋白法

同时检测四色荧光蛋白法是一种通过通过一台具有可调激光的流式细胞仪同时检测四色荧光蛋白的方法。

同时检测四色荧光蛋白法的基本原理是利用激发光谱的重迭，将多个荧光蛋白可以用同一个激发波长来激发。甚至只用 2 个激光就足可以激发 ECFP，EGFP，EYFP，和 DsRed。这 2 个激光被调至 458 nm 和 568 nm，其激发波长在现有商用流式细胞仪上并不广泛使用。很多流式安装的激光的激发波长是固定的，即 488 nm 和 633 nm。随着紫光二极管激光器的引进，现在的流式可以提供 405/407/408-nm 的激发光波长（精确的波长取决于仪器本身）。这里我们采用的是 488 nm 和 407 nm 的双激光来同时检测 ECFP，EGFP，EYFP，和 DsRed。

器材：

① 流式细胞仪，配置如下：

（1）488 nm 的激发波长作为一级激光器，407 nm 作为二级或三级激光器。

（2）检测光学装置：

A.FSC 和 SSC：488/10 nm 带通滤光片。

B.ECFP：470/20 nm 带通滤光片。

C.EGFP：510/20 nm 带通滤光片。

D.EYFP：550/30 nm 带通滤光片。

E.DsRed：610/20 nm 带通滤光片。

F. 在 510/20 nm 和 550/30 nm 带通滤光片之间安装 525 nm 短通二色棱镜。

G. 在 510/20 nm 和 610/20 nm 带通滤光片之间安装 610 nm 短通二色棱镜。

（3）激光内或激光间的补偿。

② 校准微球。

③ FACSVantage SE/FACSDiVa 的仪器设置

A. 激光光源功率：488 nm（70 mW，第一激光），407 nm（50 mW，第三激光）。

B. 电压：CFP，430 log；GFP，450 log；YFP，540 log；DsRed，580 log。

C. 光谱重叠（％）：

试剂:

① Sp2/0-Ag14 细胞（美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼西，目录号. CRL-1581）；

② 含有逆转录病毒载体的 GP＋E-86 上清，病毒载体中含有 ECFP，EGFP，EYFP，或 DsRed 荧光蛋白基因以及新霉素抗性基因（neo 基因）；

③ 0.45 μm 无菌滤膜；

④ 海美溴铵（聚凝胺）：配置 1 mg/ml 的储存液，过滤，4 ℃ 保存；

⑤ 遗传霉素 Geneticin（G418）：配置 40 mg/ml 的储存液，过滤，分装，- 20 ℃ 保存；

⑥ Sp2/0-Ag14 的培养基：Dulbecco's modified Eagle medium（DMEM）加高浓度葡萄糖，及 5％（体积比）胎牛血清；

⑦ GP＋E-86 的培养基：Dulbecco's modified Eagle medium（DMEM）加高浓度葡萄糖，及 10％（v/v）胎牛血清；

⑧ 分析缓冲液：PBS + 2％（v/v）胎牛血清。

同时检测四色荧光蛋白法基本过程可分为以下几步：

A. 建立一个前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）线性刻度的散点图。划出一个区域来去掉细胞碎片（较低的 FSC 和 SSC 值）和那些活力不好的细胞（往往出现在低 FSC 以及中到高 SSC 区域内）。

B. 建立二维的柱状图（在感兴趣的细胞群上设门），用对数刻度坐标来显示所有荧光参数组合。

C. 将细胞在分析缓冲液中重悬，当收获阴性细胞时（细胞不表达如何荧光蛋白），调节电压以使每一个荧光参数的对数值在第一刻度以内，至少收集 5 000 细胞。

D. 收集阳性细胞时的顺序：ECFP，EGFP，EYFP 或 DsRed. 每个样品至少收集 5 000 细胞。

E. 调节所有参数的补偿。正确的补偿调节应该是使每个参数的荧光强度在阴性和阳性细胞的中位值一样。

F. 画非线性的标记来圈出不同的细胞群。

G. 混合相同比例的列组分：阴性细胞，ECFP 阳性细胞，EGFP 阳性细胞，EYFP 阳性细胞，DsRed 阳性细胞。收集 50 000 细胞图，进行补偿调节。

H.（可选）混合阴性细胞和表达每个荧光蛋白的细胞，以及同时表达 4 种蛋白的细胞。收集 50 000 细胞图，进行补偿调节图。

I. 数据显示

在流式细胞术，所有的信号的测量是依据至少两个基本的变量：光子计数（计数误差）和摸拟信号向数字信号转换（数字误差），两者都是强度依赖的和对称的。当数据被进行补偿调节和以 log 值显示时，可能会产生微小的但不容忽视的问题。因为信号补偿是一个消减的过程，一些事件在补偿后可能会产生负的计算通道值。如果数据能够在线性范围内被充分地显示，那么测量的可变性会在对照组范围内以一个强度依赖的对称式增加。当经过补偿的数据被转换成 log 值时，若 log 函数没有被定义为小于或等于 0 时，那么负的和零通道的值通常设定为 1。这种数据的处理会导致两个不良的后果：第一，在坐标轴上的数据会被删除，而不容易被很好地显示；第二，可变性不再对称，结果数据不能被补偿调节。第一个问题可以通过添加一个小的随机数值来规避。尽管这一做法可以使坐标轴上的细胞被显示，但是不能改变更重要的对称性的丧失和接下来的数据的错误诠释。第二个问题最近有两种转换可以解决，即双指数和超对数，这两者具有对数转换的所有优势，但是根据全部真实的区域来定义的，并包括 0 和负数在内。这种转换的优势是保留了测量误差的对称性，使其可以很容易地正确补偿数据。