稳定表达ECFP、EGFP、EYFP和（或）DsRed蛋白的细胞系的建立

稳定表达 ECFP、EGFP、EYFP 和（或）DsRed 蛋白的细胞系的建立是用流式细胞仪同时检测四色荧光蛋白要求这些细胞要表达每一种蛋白，同时，能够表达多个荧光蛋白的细胞可以用来确认分群的正确性。

器材：

① 流式细胞仪，配置如下：

（1）488 nm 的激发波长作为一级激光器，407 nm 作为二级或三级激光器。

（2）检测光学装置：488/10 nm 带通滤光片，470/20 nm 带通滤光片，510/20 nm 带通滤光片，550/30 nm 带通滤光片，610/20 nm 带通滤光片，525 nm 短通二色棱镜，及 610 nm 短通二色棱镜（伯瑞特波罗，佛蒙特州）。

（3）激光内或激光间的补偿。

② 校准微球。

试剂:

① Sp2/0-Ag14 细胞（美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼西，目录号. CRL-1581）；

② 含有逆转录病毒载体的 GP＋E-86 上清，病毒载体中含有 ECFP，EGFP，EYFP，或 DsRed 荧光蛋白基因以及新霉素抗性基因（neo 基因）；

③ 0.45 μm 无菌滤膜；

④ 海美溴铵（聚凝胺）：配置 1 mg/ml 的储存液，过滤，4 ℃ 保存；

⑤ 遗传霉素 Geneticin（G418）：配置 40 mg/ml 的储存液，过滤，分装，- 20 ℃ 保存；

⑥ Sp2/0-Ag14 的培养基：Dulbecco's modified Eagle medium（DMEM）加高浓度葡萄糖，及 5％（体积比）胎牛血清；

⑦ GP＋E-86 的培养基：Dulbecco's modified Eagle medium（DMEM）加高浓度葡萄糖，及 10％（v/v）胎牛血清；

⑧ 分析缓冲液：PBS＋2％（v/v）胎牛血清。

稳定表达 ECFP、EGFP、EYFP 和（或）DsRed 蛋白的细胞系的建立基本过程可分为以下几步：

A. 采用逆转录病毒载体将荧光蛋白基因导入 Sp2/0-Ag14 细胞。

B. 来自 GP＋E-86 细胞的上清被收集并且过 0.45 μm 的滤膜，以从病毒颗粒县液中滤过任何混入的细胞。

C. 培养 Sp2/0-Ag14 细胞，将含有 ECFP，EGFP，EYFP，或 DsRed 蛋白逆转录病毒载体的上清加入，并加 2 μg/ml 聚凝胺，37 ℃ 培养 4 h。

D. 加新鲜病毒上清重复上面步骤，2 天后，加 G418（750 μg/ml）来筛选表达每种荧光蛋白的细胞。另外，利用上述同样的操作步骤，可获得表达四色蛋白的细胞，只不过是同时加 4 种荧光蛋白的逆转录病毒载体。