树突状细胞的混合淋巴细胞反应

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前公认的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞（professional antigen presenting cell，APC）， 在免疫应答的首要环节--抗原提呈过程中扮演着重要的角色，是唯一能够活化初始 Th 细胞的 APC，成为适应性免疫应答的始动者；同时，DC 也在诱导机体的免疫耐受中发挥重要作用。

在免疫稳定状态下，分布于外周非淋巴组织的 DC 处于非成熟状态，主要功能为识别和摄取抗原。与其功能相适应，非成熟 DC 表面表达低水平的 MHC II 类分子和共刺激分子，高表达一系列受体以便于识别与病原体相关的物质，包括多种 Toll 样受体（Toll like receptor，TLR），C 型凝集素如甘露糖受体、DEC205 等。一旦发生感染或组织损伤，非成熟 DC 就会向炎性部位迁移，摄取加工抗原，并释放大量的炎性因子，激发天然免疫应答，避免感染的扩散。

相应地，非成熟 DC 发生了一系列的变化，获得了成熟表型及功能：

① 丢失用于吞噬的受体；

② 高表达 MHC II 类分子和共刺激分子，包括 CD40、CD80 和 CD86；

③ 形态发生改变；

④ 启动抗原处理机制，包括溶酶体相关的膜蛋白（DC-LAMP）的水平增加。同时，成熟 DC 的趋化因子受体表达谱发生变化，CCR1、CCR5 和 CCR6 等的表达降低，而 CCR7 的表达会增高，从而促使 DC 从外周组织沿传入淋巴管迁移至邻近的次级淋巴组织，与初始 T 细胞相遇，诱导其活化并增殖成为抗原特异性的效应 T 细胞，从而启动免疫应答。因此，DC 在非成熟期和成熟期的表型和功能各不相同。

试剂：

（1）反应细胞：来自脾、淋巴结、胸腺的淋巴细胞或纯化的 T 细胞和 T 细胞亚群。

（2）刺激细胞：同种异体小鼠脾细胞（H-2 位点不同）或人同种异体外周血单个核细胞（PBMC），经照射或丝裂霉素C 处理，或去除 T 细胞。

（3）3 H 标记甲基胸腺嘧啶核苷（H-TdR）。

（4）100% 乙醇。

（5）闪烁液。

仪器：

96 孔培养板、多孔收集器、玻璃纤维滤纸、液闪管、β液闪仪

树突状细胞的混合淋巴细胞反应的基本过程可分为以下几步：

（1）反应细胞的制备：根据预计细胞浓度准备反应细胞，然后倍比稀释至每孔 0.5 x 10⁵ 个、1 x 10⁵ 个、2 x 10⁵ 个和 4 x 10⁵ 个细胞，每孔 100 μl，各浓设置 3 个复孔，每实验组应设立 3 个复孔。

（2）刺激细胞的制备：为避免刺激细胞中 T 细胞的增殖反应，可通过照射或丝裂霉素 C 处理抑制细胞增殖，或者去除 T 细胞。

① 丝裂霉素 C 处理：调整细胞浓度至 1 x 106 个/ml，加入丝裂霉素 C，至终浓度 25 μg/ml，37 ℃、5% CO2 孵育 30 分钟。完全培养基离心洗涤 3 次去除残余丝裂霉素 C（丝裂霉素 C 应避光保存，用时新鲜配制）。

② 也可用射线照射（10～20 Gy）灭活 T 细胞的方法。

③ 从刺激细胞中去除 T 细胞：因小鼠外周 T 细胞均表达细胞表面抗原 Thy-1，因此可利用抗 Thy-1 单克隆抗体加补体的方法去除 T 细胞。还可进一步利用 Percoll 密度梯度离心法富集 APC，或者利用 MACS 阴性分选去除 T 细胞。

（3）每孔加入 100 μl 经照射或丝裂霉素 C 处理或去除 T 细胞的刺激细胞（反应细胞与刺激细胞的比例应预先滴定）。单独反应细胞和单独刺激细胞作为阴性对照。

（4）37 ℃、5% CO2 培养 5～7 天，结束培养前 18 小时每孔加入 1 μCi 3 H-TdR。

（5）用半自动样品收集器收集样品，并用β液闪仪检测 cpm 值。

（6）计算 Δ cmp 值：用实验组（刺激组）3 个复孔的 cmp 平均值减去对照组（未加刺激剂组）3 个复孔的平均值，得出实验组的 Δ cmp 值。