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树突状细胞的混合淋巴细胞反应

相关实验:树突状细胞表型和功能检测

最新修订时间:

简介

树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前公认的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞(professional antigen presenting cell,APC), 在免疫应答的首要环节--抗原提呈过程中扮演着重要的角色,是唯一能够活化初始 Th 细胞的 APC,成为适应性免疫应答的始动者;同时,DC 也在诱导机体的免疫耐受中发挥重要作用。

在免疫稳定状态下,分布于外周非淋巴组织的 DC 处于非成熟状态,主要功能为识别和摄取抗原。与其功能相适应,非成熟 DC 表面表达低水平的 MHC II 类分子和共刺激分子,高表达一系列受体以便于识别与病原体相关的物质,包括多种 Toll 样受体(Toll like receptor,TLR),C 型凝集素如甘露糖受体、DEC205 等。一旦发生感染或组织损伤,非成熟 DC 就会向炎性部位迁移,摄取加工抗原,并释放大量的炎性因子,激发天然免疫应答,避免感染的扩散。

相应地,非成熟 DC 发生了一系列的变化,获得了成熟表型及功能:

① 丢失用于吞噬的受体;

② 高表达 MHC II 类分子和共刺激分子,包括 CD40、CD80 和 CD86;

③ 形态发生改变;

④ 启动抗原处理机制,包括溶酶体相关的膜蛋白(DC-LAMP)的水平增加。同时,成熟 DC 的趋化因子受体表达谱发生变化,CCR1、CCR5 和 CCR6 等的表达降低,而 CCR7 的表达会增高,从而促使 DC 从外周组织沿传入淋巴管迁移至邻近的次级淋巴组织,与初始 T 细胞相遇,诱导其活化并增殖成为抗原特异性的效应 T 细胞,从而启动免疫应答。因此,DC 在非成熟期和成熟期的表型和功能各不相同。

原理

树突状细胞的混合淋巴细胞反应的基本原理是反应性 T 细胞受到同种异体淋巴细胞(主要是 DC)表面异体组织相容抗原的刺激作用(主要是通过直接识别机制)发生增殖反应。本方法常用于临床鉴定组织相容性。另外,利用 3 H 标记的胸腺嘧啶核苷(3 H-TdR)掺入法检测 T 细胞增殖灵敏度高,但容易造成同位素污染,逐渐被其他方法取代。

材料与仪器

试剂:

(1)反应细胞:来自脾、淋巴结、胸腺的淋巴细胞或纯化的 T 细胞和 T 细胞亚群。

(2)刺激细胞:同种异体小鼠脾细胞(H-2 位点不同)或人同种异体外周血单个核细胞(PBMC),经照射或丝裂霉素C 处理,或去除 T 细胞。

(3)3 H 标记甲基胸腺嘧啶核苷(H-TdR)。

(4)100% 乙醇。

(5)闪烁液。

仪器:

96 孔培养板、多孔收集器、玻璃纤维滤纸、液闪管、β液闪仪

步骤

树突状细胞的混合淋巴细胞反应的基本过程可分为以下几步:

(1)反应细胞的制备:根据预计细胞浓度准备反应细胞,然后倍比稀释至每孔 0.5 x 105 个、1 x 105 个、2 x 105 个和 4 x 105 个细胞,每孔 100 μl,各浓设置 3 个复孔,每实验组应设立 3 个复孔。

(2)刺激细胞的制备:为避免刺激细胞中 T 细胞的增殖反应,可通过照射或丝裂霉素 C 处理抑制细胞增殖,或者去除 T 细胞。

① 丝裂霉素 C 处理:调整细胞浓度至 1 x 106 个/ml,加入丝裂霉素 C,至终浓度 25 μg/ml,37 ℃、5% CO2 孵育 30 分钟。完全培养基离心洗涤 3 次去除残余丝裂霉素 C(丝裂霉素 C 应避光保存,用时新鲜配制)。

② 也可用射线照射(10~20 Gy)灭活 T 细胞的方法。

③ 从刺激细胞中去除 T 细胞:因小鼠外周 T 细胞均表达细胞表面抗原 Thy-1,因此可利用抗 Thy-1 单克隆抗体加补体的方法去除 T 细胞。还可进一步利用 Percoll 密度梯度离心法富集 APC,或者利用 MACS 阴性分选去除 T 细胞。

(3)每孔加入 100 μl 经照射或丝裂霉素 C 处理或去除 T 细胞的刺激细胞(反应细胞与刺激细胞的比例应预先滴定)。单独反应细胞和单独刺激细胞作为阴性对照。

(4)37 ℃、5% CO2 培养 5~7 天,结束培养前 18 小时每孔加入 1 μCi 3 H-TdR。

(5)用半自动样品收集器收集样品,并用β液闪仪检测 cpm 值。

(6)计算 Δ cmp 值:用实验组(刺激组)3 个复孔的 cmp 平均值减去对照组(未加刺激剂组)3 个复孔的平均值,得出实验组的 Δ cmp 值。

注意事项

反应时间依细胞类型和实验条件而定。

来源:丁香实验

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