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混合淋巴细胞培养

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细胞培养 (Cell Culture)专题:

  混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型,以测定受体和供体主要组织相容性抗原 (HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖,产生种类众多的细胞因子,促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化,因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。

  (一) 实验原理

  两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时,由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原(淋巴细胞鉴定的抗原,SD抗原)不同,可相互刺激对方的T细胞发生增殖,此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC);若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力,但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化,称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。

两个个体间HLA抗原差异程度越大,反应越强烈,可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell,HTC)作为刺激细胞,则可检测待检者的D位点抗原型别。

若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同,MLC不发生增殖,此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原,常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

  (二) 操作步骤

  1. 刺激细胞的准备 常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴母细胞(如N23细胞株,经过克隆化)、HTC或PBMC。取处于对数生长期的N23细胞,离心后重悬于新鲜完全培养基中,调整细胞数为1~2×106/ml,移置塑料培养瓶或50ml离心管中,用60Co照射3000ra.

  2. 反应细胞的准备  分离纯化待检个体的PBMC(方法参见"密度梯度离心法分离PBMC")。

  3. MLC按2×106PBMC: 1×105照射的N23细胞/4ml 10% FCS RPMI1640 比例在培养瓶中进行MLC,培养瓶保持直立,培养4天内不要晃动,第5天加入1ml新鲜培基。

如要测定3-TdR掺入率,一般可在MLC的第5天进行;如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞(犆TL),一般在7~10天左右终止培养,收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见"自然伤细胞(NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的杀伤功能",所不同的是在96孔培养板中靶细胞数为5×103/孔。

CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N23细胞。

  (三) 试剂器材

  1. 细胞 刺激细胞N23细胞系,反应细胞:外周血单个核细胞。

  2. 10%FCS RPMI1640培养基。

  3. 照射源:60Co、X射线装置。

  4. 细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。

  5. Co孵箱、超净台。

  (四) 注意事项

  1. 注意无菌操作。

  2. 刺激细胞接受照射剂量要准确,使细胞暂时存活,但失去增殖的能力。

  3. 可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞,也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。


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