混合淋巴细胞培养

细胞培养 （Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/cellculture.htm

　　混合淋巴 细胞培养 (MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。
　　(一)　实验原理
　　两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原(淋巴细胞鉴定的抗原,SD抗原)不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC);若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或３H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell,HTC)作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴 细胞培养 中的刺激细胞。
　　(二)　操作步骤
　　1.　刺激细胞的准备　常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴母细胞(如N２３细胞株，经过克隆化)、HTC或PBMC。取处于对数生长期的N２３细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为1～2×10６／ml，移置塑料培养瓶或50ml离心管中，用６０Co照射3000rad。
　　2.　反应细胞的准备　　分离纯化待检个体的PBMC（方法参见"密度梯度离心法分离PBMC"）。
　　3.　MLC按2×10６PBMC: 1×10５照射的N２３细胞／4ml 10％ FCS RPMI1640 比例在培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4天内不要晃动，第5天加入1ml新鲜培基。如要测定３-TdR掺入率，一般可在MLC的第5天进行；如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞(犆TL)，一般在7～10天左右终止培养，收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见"自然伤细胞(NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的杀伤功能"，所不同的是在96孔培养板中靶细胞数为5×10３／孔。CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N２３细胞。
　　(三)　试剂器材
　　1.　细胞　刺激细胞N23细胞系，反应细胞：外周血单个核细胞。
　　2.　10％FCS　RPMI1640培养基。
　　3.　照射源：６０Co、X射线装置。
　　4.　细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。
　　5.　Co孵箱、超净台。
　　(四)　注意事项
　　1.　注意无菌操作。
　　2.　刺激细胞接受照射剂量要准确，使细胞暂时存活，但失去增殖的能力。
　　3.　可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。

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