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MLR混合淋巴细胞反应

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混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型,以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖,产生种类众多的细胞因子,促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化,因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。

一、实验原理

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时,由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原(淋巴细胞鉴定的抗原,SD抗原)不同,可相互刺激对方的T细胞发生增殖,此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC);若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力,但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化,称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。两个个体间HLA抗原差异程度越大,反应越强烈,可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell,HTC)作为刺激细胞,则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同,MLC不发生增殖,此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原,常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

二、实验方法

这里介绍多年前做过的MLR的方法,绝对正宗,传统的标准方法:

1、方法

分别取C57BL(H-2b)和Balb/C(H-2d)小鼠脾脏制备细胞悬液,Balb/C小鼠脾细胞悬液(2X107/ml)加丝裂霉素C(50微克/ml)处理,37oC,30min,培养液洗涤3次后用5%NBS培养液配制细胞悬液(5X106/ml),作为刺激细胞,加入96孔培养板,5X105/0.1ml/孔; 再加入C57BL脾细胞悬液,为反应细胞,也是5X105/0.1ml/孔;另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔,均为三复孔。CO2孵葙培养5天,加3H-TdR 0.5 微居/孔,再培养12~16h后,收集细胞于玻璃纤维滤纸上,干燥后用液闪法测定cpm值, 根据以下公式计算刺激指数(SI):

SI=(混合反应细胞孔cpm-刺激细胞孔cpm值)/ 反应细胞孔cpm值

2、结果

Balb/C小鼠6-8周龄脾细胞对C57BL小鼠脾细胞的MLR的SI为:13.5

出生后0~2天去胸腺的Balb/C小鼠,6-8周龄的脾细胞的MLR的SI:3.0

三、注意事项

1、注意无菌操作。

2、刺激细胞接受照射剂量要准确,使细胞暂时存活,但失去增殖的能力。

3、可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞,也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。

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