免疫磁珠法分离 B 淋巴细胞

最新修订时间：2022-02-10

简介

B 淋巴细胞的分离是利用 B 细胞多种生物学特性，如 B 细胞表达 CD19、CD20 分子，具有膜免疫球蛋白等，可将 B 细胞与其他细胞进行分离。免疫磁珠法分离 B 淋巴细胞操作简便、快捷，能够在短时间内分选出大量纯度较高的 B 细胞，从而保证细胞活性。

原理

免疫磁珠法分离 B 淋巴细胞分正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。免疫磁珠法分离 B 淋巴细胞的基本原理是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。阳性分选法中与磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；阴性分选法中与磁珠结合的细胞为不需要细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞。

材料与仪器

试剂：

1. 小鼠或人淋巴细胞悬液

2. 小鼠或人 CD19 阳性分选免疫磁珠

3. 含 10％ FCS 的 RPMI 1640 培养液

4. 分选缓冲液（含 0.5％BSA 的无菌 PBS 液）

仪器：

1. Midi MACS 分离磁铁

2. MACS 多用支架

3. LS 分选柱

4. 15 ml 无菌离心管、3 ml 移液滴管

5. 低温离心机

6. 超净台

步骤

免疫磁珠法分离 B 淋巴细胞的基本过程可分为以下几步：

（1）洗涤细胞悬液

① 分离人外周血 PBMC 后，用 4 ℃ 预冷的分选缓冲液洗涤细胞 2 次，重悬细胞 100x10⁶/500 μl；

② 分离小鼠脾脏单个核细胞，取 2～3 只小鼠的脾脏制备单个核细胞，去除红细胞后用 4℃ 预冷的无菌分选缓冲液洗涤细胞 2 次，重悬细胞 100x10⁶/500 μl。

（2）孵育免疫磁珠

加入 CD19＋MicroBeads 20 μl/10x10⁶ 个细胞，混匀，4 ℃ 避光 15 分钟。

（3）安装 LS 分选柱

在孵育磁珠期间，将 MidiMACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上，并将 LS 分选柱放入磁体中，在分选柱下放一个无菌的 15 ml 离心管。

（4）细胞过柱

用 10 ml 4 ℃ 预冷的分选缓冲液终止磁珠孵育，混悬后 4 ℃ 离心（200 g，10 分钟）；离心期间，用 3 ml 4 ℃ 预冷的分选缓冲液润洗 LS 分选柱，润洗结束后在分选柱下放置一个新的无菌 15 ml 离心管；细胞离心结束后，弃去洗液，按 100x10⁶/500 μl 重悬细胞；细胞混悬后加入 LS 分选柱中，在液体即将流尽时加 3 ml 分选缓冲液冲洗分选，共 3 次。

（5）收集 B 细胞

将 LS 分选柱从磁体中取出，放在一个新的无菌 15 ml 离心管上，加 5 ml 分选缓冲液于分选柱中，将活塞塞进分选柱并挤压洗脱阳性细胞，即 B 细胞。

（6）重悬 B 细胞

200 g 离心 10 分钟收集 B 细胞，弃去上清后用含 10％ FCS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞沉淀，计数细胞后调整细胞浓度为 2x10/ml，用于后续细胞培养。

注意事项

（1）样本须为去除血小板的外周血单个核细胞。

（2）死细胞对于微珠有非特异性的影响，当样本中死细胞数量太多，可以用 Ficoll 梯度密度离心法先去除死细胞。

（3）润洗分选柱或加细胞悬液于分选柱时，应垂直加入液体，避免产生气泡和细胞团块。

（4）实验过程保证无菌操作，所用缓冲液均需要提前 4 ℃ 预冷，并采用 4 ℃ 离心。

来源：丁香实验