（交流）尼龙毛法分离淋巴细胞

前两天收到一战友的PM，主要是和我讨论关于“尼龙毛法分离淋巴细胞”实验中遇到的一些问题，在交流中发现其应用的方法与我的相差还挺大的，主要是尼龙毛的处理等过程中差异性较大，但是我们所用方法的主要目的应该是一致的。因现在文献中的尼龙毛分离方法的描述不是很详细，除此之外，我所用的这个方法，分离的T/B细胞的纯度较为理想,并且是我们根据相关的文献，和实际的操作中总结出来的。
故把我的实验记录贴于此，希望通过大家的交流，使在分离淋巴细胞方面我们收获更多。

尼龙毛法分离淋巴细胞

试剂：
PBMC，1640（20ML），1640+10%FCS （50ML），75%医用酒精（50ML）。

材料：
塑料软管（0.5CM，15CM，饮料的吸管也可，1支），尼龙毛（0.2G），5ML一次性注射器，(1支），高压灭菌用饭盒（2个），塑料平皿（1个），玻璃平皿（２个），玻璃试管（５个)

方法：

准备尼龙毛柱：
一，处理尼龙毛，
1，0.2g尼龙毛，撕匀，
2，0.2mol/l HCL泡24H，
3，大量蒸馏水冲洗
4，平铺玻璃皿，于干燥箱（50摄氏度）
5，烘干（12H）后，高压灭菌
二，处理吸管
1，1支吸管
2，0.2mol/l HCL泡24H，
3，大量蒸馏水冲洗
4，无菌饭盒内，烘干
5，75%酒精冲洗，自然烘干
三，组装尼龙毛柱
1，超净台内，酒精洗手2遍，
2，撕匀的尼龙毛，用长细棍（酒精灯冲洗自动铅笔芯（0.5mm,10cm)引入尼龙毛于吸管中，毛位于吸管中部，两端空出2cm，
3，5ml注射器吸取1640，注入吸管，浸透尼龙毛，
4，制备好的尼龙毛柱于灭菌饭盒，-20摄氏度保存一个月。

过柱（尼龙毛柱分离PBMC）
1，平衡毛柱：37摄氏度，1640+10%FCS，5ML，注入吸管（37摄氏度温育待用）
2，注射器吸取1mlPBMC（2X107/ML，37摄氏度）垂直加入毛柱，再加入数滴（1640+10%FCS）
3，平放毛柱于灭菌饭盒内，37摄氏度，60MIN，
4，毛柱垂直放入10ML玻璃管，注射器吸取5ML，37摄氏度1640+10%FCS，缓缓注入毛柱（60滴/min）（手动控制）
5，洗脱液富含T细胞，离心弃上清，
6，毛柱放入第二玻璃管，10ml，37摄氏度1640+10%FCS，同样洗涤
7，保留洗脱液，离心弃上清。（洗脱液中，T，B细胞均有，但纯度不高）
8，毛柱放入第三支玻璃管，注射器吸取5ml，冰冷的1640+10%FCS，缓缓注入毛柱（且轻轻挤压毛柱），洗脱液富含B细胞，离心弃上清。（冰冷的1640+10%FCS，降低B细胞的黏附性，挤压下B细胞洗脱下来）