简介
B 淋巴细胞的分离是利用 B 细胞多种生物学特性,如 B 细胞表达 CD19、CD20 分子,具有膜免疫球蛋白等,可将 B 细胞与其他细胞进行分离。
原理
流式细胞术分选 B 淋巴细胞的基本原理是通过直接或间接荧光标记法标记 B 细胞,应用流式细胞仪分选 B 细胞。
材料与仪器
试剂:
① 连接有荧光素的抗小鼠或人 CD19 的单克隆抗体
② 含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养液
③ 分选缓冲液(含 0.5% BSA 的无菌 PBS 液)
仪器:
15 ml 无菌离心管、流式细胞分选仪
步骤
流式细胞术分选 B 淋巴细胞的基本过程可分为以下几步:
(1)制备细胞悬液
① 分离人外周血 PBMC,用 4 ℃ 预冷的分选缓冲液洗涤细胞 2 次,重悬细胞浓度为 100x10/500 μl;
② 分离小鼠脾脏单个核细胞,取 2~3 只小鼠的脾脏制备单个核细胞,去除红细胞后用 4 ℃ 预冷的分选缓冲液洗涤细胞 2 次,重悬细胞浓度为 100x106/500 μl。
(2)荧光抗体标记 B 细胞
加适量连接有荧光素的抗小鼠/人 CD19 的单克隆抗体,混匀后 4 ℃ 避光 30 分钟。
(3)流式细胞仪分选 B 细胞群
孵育抗体结束后,用分选缓冲液洗涤细胞 2 次,再用 500 μl 含 0.5% BSA 的无菌 PBS 液重悬细胞,调试流式细胞仪,设门于 B 细胞群,进行流式分选。
注意事项
(1)实验过程保证无菌操作,所用缓冲液均需要提前 4 ℃ 预冷,并采用 4 ℃ 离心。
(2)流式细胞仪分选细胞的量有一定的限制,一次分选的最大合理量约为 108 个细胞。分选细胞数量过多,操作时间过长将影响细胞活性。
来源:丁香实验