E花结形成分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞

互联网2010-12-02

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E 花结形成分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞

为了深入研究T、B细胞的生物学特性和功能，必需从淋巴细胞群体中分离出单一的T细胞或B细胞，以满足实验要求。根据T、B细胞膜表面标志及粘附能力等特性的不同，可将两者加以分离，常用的方法有E花结形成法、免疫吸附法和免疫磁性微珠分离法，近年来应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或亚群。

（一）

此法是基于成熟的T细胞表面有独特的绵羊红细胞(SRBC)受体,即E受体（CD2），能够与SRBC结合形成E-花环，而B细胞则不能，经Ficoll- Hypaque密度梯度离心后，即可将二者分开，然后裂解E-花环中的SRBC，即可获得纯T细胞，而B细胞可直接取自分层液的界面。

近年来，用2-氨乙基异硫溴化物（AET）处理SRBC后，可增加E-花环形成效果与稳定性，从而提高T细胞的分离效率。

【试剂及配制】

（1） AET溶液：称取AET粉剂402mg,溶于10ml去离子水中，用4mol/L NaOH溶液约9～10滴，调至pH9.0，用0.2μm滤膜过滤除菌。用前临时配制。

（2）分离单个核细胞所需试剂

（3） Hank’s液

（4） 3.5%NaCl溶液

【操作方法】

（1）从新鲜血液分离单个核细胞。

（2） AET-SRBC的制备：无菌取保存于Alsever液中的SRBC 5ml，加20培体积的无菌等渗盐溶液，1800r/min离心5min，连续洗涤5次后，取2ml压积的SRBC，充分混匀，使SRBC完全分散，加入8ml新鲜配制的pH9.0的AET溶液，置37℃水浴15min，每隔5min摇匀一次。

加入预冷无菌等渗盐溶液至离心管口1～2cm处，1800r/min离心5min，连续洗涤5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET使SRBC粘附成团，并观察有无溶血。如有溶血现象，则用含小牛血清的RPMI-1640液再洗一次，最后配成10% AET-SRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。

使用时用10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至1% ；

（3） AET-E花环实验：将分离的单个核细胞（2×106 /ml）与等量1% AET-SRBC混合，置37℃水浴15min，每5min摇匀一次，然后分数管，每管2～3ml，低速离心（1000r/min）5min后，移至4℃冰箱45min；

（4） T淋巴细胞和B细胞的分离：将形成E-花环的细胞悬液，再用聚蔗糖-泛影葡胺分层液同法分离，吸取界面云雾状的细胞层，即为富含非T淋巴细胞群（富含B细胞）。取沉淀于管底的E花环，用Hank’s液洗一次后，加双蒸水3ml处理3s，低渗裂解E-花环周围SRBC，立即加3.5%NaCl溶液1ml，使还原为等渗，低速离心沉淀，即的富含T淋巴细胞群。

【注意事项】

（1） 10% AET-SRBC悬液不宜保存太久，且要注意有否溶血。

（2）小牛血清用SRBC吸收后使用为佳，以免其所含凝集素影响实验结果。

（3） AET-SRBC花环形成后，应立即计数，否则当37℃温热后，花环可解离。

（4）所用溶液pH以7.2～7.4为易，温度在30℃以上或10℃以下可影响E花环形成，最适温度为23℃±2℃。

（5）为了获得更纯的B细胞，可往B细胞制备中加入抗T细胞的单抗和补体，经保温破坏混入的少量的T细胞；与此相应，T细胞制备中加入抗B细胞抗体和补体，可进一步纯化T细胞。

【鉴定】

分别采用CD3、CD19单抗间接免疫荧光试验鉴定T、B细胞纯度，台盼蓝拒染法计存活率。