E 花结形成分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞
为了深入研究T、B细胞的生物学特性和功能,必需从淋巴细胞群体中分离出单一的T细胞或B细胞,以满足实验要求。根据T、B细胞膜表面标志及粘附能力等特性的不同,可将两者加以分离,常用的方法有E花结形成法、免疫吸附法和免疫磁性微珠分离法,近年来应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或亚群。
(一)
此法是基于成熟的T细胞表面有独特的绵羊红细胞(SRBC)受体,即E受体(CD2),能够与SRBC结合形成E-花环,而B细胞则不能,经Ficoll- Hypaque密度梯度离心后,即可将二者分开,然后裂解E-花环中的SRBC,即可获得纯T细胞,而B细胞可直接取自分层液的界面。
近年来,用2-氨乙基异硫溴化物(AET)处理SRBC后,可增加E-花环形成效果与稳定性,从而提高T细胞的分离效率。
【试剂及配制】
(1) AET溶液:称取AET粉剂402mg,溶于10ml去离子水中,用4mol/L NaOH溶液约9~10滴,调至pH9.0,用0.2μm滤膜过滤除菌。用前临时配制。
(2) 分离单个核细胞所需试剂
(3) Hank’s液
(4) 3.5%NaCl溶液
【操作方法】
(1) 从新鲜血液分离单个核细胞。
(2) AET-SRBC的制备:无菌取保存于Alsever液中的SRBC 5ml,加20培体积的无菌等渗盐溶液,1800r/min离心5min,连续洗涤5次后,取2ml压积的SRBC,充分混匀,使SRBC完全分散,加入8ml新鲜配制的pH9.0的AET溶液,置37℃水浴15min,每隔5min摇匀一次。
加入预冷无菌等渗盐溶液至离心管口1~2cm处,1800r/min离心5min,连续洗涤5次,每洗一次,必须充分摇匀,以减少AET使SRBC粘附成团,并观察有无溶血。如有溶血现象,则用含小牛血清的RPMI-1640液再洗一次,最后配成10% AET-SRBC悬液,置4℃保存,不得超过5天。
使用时用10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至1% ;
(3) AET-E花环实验:将分离的单个核细胞(2×106 /ml)与等量1% AET-SRBC混合,置37℃水浴15min,每5min摇匀一次,然后分数管,每管2~3ml,低速离心(1000r/min)5min后,移至4℃冰箱45min;
(4) T淋巴细胞和B细胞的分离:将形成E-花环的细胞悬液,再用聚蔗糖-泛影葡胺分层液同法分离,吸取界面云雾状的细胞层,即为富含非T淋巴细胞群(富含B细胞)。取沉淀于管底的E花环,用Hank’s液洗一次后,加双蒸水3ml处理3s,低渗裂解E-花环周围SRBC,立即加3.5%NaCl溶液1ml,使还原为等渗,低速离心沉淀,即的富含T淋巴细胞群。
【注意事项】
(1) 10% AET-SRBC悬液不宜保存太久,且要注意有否溶血。
(2) 小牛血清用SRBC吸收后使用为佳,以免其所含凝集素影响实验结果。
(3) AET-SRBC花环形成后,应立即计数,否则当37℃温热后,花环可解离。
(4) 所用溶液pH以7.2~7.4为易,温度在30℃以上或10℃以下可影响E花环形成,最适温度为23℃±2℃。
(5) 为了获得更纯的B细胞,可往B细胞制备中加入抗T细胞的单抗和补体,经保温破坏混入的少量的T细胞;与此相应,T细胞制备中加入抗B细胞抗体和补体,可进一步纯化T细胞。
【鉴定】
分别采用CD3、CD19单抗间接免疫荧光试验鉴定T、B细胞纯度,台盼蓝拒染法计存活率。