免疫磁性微珠分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞

材料及试剂

1. 磁性激活细胞分离器（MACS）：MACS柱（C型，可结合2×108 个细胞）生物素标记的抗CD4单抗和抗CD8单抗

2. 生物素标记的羊抗鼠IgG F(Fab)2

3. FITC标记的亲和素

4. 生物素标记的磁性微珠

5. MACS柱染色洗涤液、MACS柱洗脱液（含1%牛血清白蛋白的PBS）和MACS柱

6. 浸湿液（含10%牛血清白蛋白的PBS）

7. 人悬液或淋巴细胞悬液

8. RPMI-1640细胞培养液

操作方法

1. MACS柱的准备新MACS柱需高压灭菌，60℃烘干后备用。使用前（至少2h前）应准备完毕。将2～3个C型MACS柱内分别用10ml注射器在柱下三通阀们处加入10mlMACS柱浸湿液，使液面达到柱内铁丝基质平面上2～3Cm处，关闭柱下三道阀们备用；

2. 将人PBMC悬液或淋巴细胞悬液（含2×108 个细胞）离心，重新悬浮于0.15ml MACS染色洗涤液中，加入生物素标记的CD4单抗和抗CD8单抗各25ul（比例为0.05ug/106 个细胞），冰浴孵育25min。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min,5min），重新悬浮与0.15ml MACS染色洗涤液中，加入50ul生物素标记的羊抗鼠IgG F(Fab)2 （比例为0.05ug/106 个细胞），冰浴孵育25min。

用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min，5min），重新悬浮与0.15ml MACS染色洗涤液中，加入50ul FITC标记的亲和素（比例为0.08ug/106 个细胞），冰浴孵育15min。

用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min,5min），重新悬浮与0.15ml MACS染色洗涤液中，加入生物素标记的磁性微珠（比例为5ul/108 个细胞），冰浴孵育5～10min。在加入3ml MACS柱洗脱液；

3. 将MACS柱放入MACS磁铁槽内，用20ml MACS柱洗脱液洗柱，待液体降至柱内铁丝基质平面上2～3处，关闭三通阀们。将细胞悬液置于MACS柱内。

在柱下放一支50ml的试管，打开阀们，使其流速为3～5ml/min，边流边加MACS柱洗脱液，每个柱内至少加柱洗脱液30ml。试管内的洗脱液中为CD4-CD8-细胞（即阴性分离）。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用；

4. 将MACS柱移出磁场外，用MACS柱洗脱液洗柱（较大流速），则该洗脱液中为CD4+、CD8+或CD4+CD8+细胞（即阳性分离）。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用；

5. 再用另外两个MACS柱重复上述过柱过程，以提高细胞分离纯度；

6. 结果评价：分别取上述两种细胞悬液个0.5ml，在流式细胞仪(FCM)上进行测定分析，FITC阴性细胞（阴性分离细胞）为CD4-、CD8-细胞，而FITC阳性细胞（阳性分离细胞）为CD4+、CD8+或细胞CD4+CD8+细胞。如果FITC阴性细胞中FITC阳性细胞率高于5%～10%，则需重复进行MACS分离过程。

MACS分离细胞具有高纯度（一般为95%～99%）等特点。其分离效果与流式细胞仪的细胞分离效果相媲美，并具有比流式细胞仪分离术经济、省事节时、操作简单、快速等优点。

注意事项

1. MACS柱用毕后需立即用双蒸水冲洗干净（或用同等柱体积量的PBS洗涤20次），再以20倍于柱体积的无菌双蒸水和5倍于柱体积的95%乙醇溶液洗涤，37℃下烘干，高压灭菌备用。

2. 有各种不同容量的MACS柱，可根据需要选择。

3. 不要将组织块或大细胞团块加入柱内，以免造成堵塞进而毁坏MACS柱。

4. 洗脱MACS柱时，流速越慢则分离细胞的纯度越高。为了获得高纯度的阴性分离的细胞群体或除去某种细胞，可重复过柱3次，第一次过柱时流速可快些（6ml/min）。如果仅为了获得阳性细胞，则流速可少快(3.5～5ml/min)。

5. 在MACS柱上加入液体时不要产生气泡。

6. 在分离洗脱时，柱内液体不要低于柱内的铁丝基质平面以下，即始终让铁丝基质内含有液体，否则细胞分离将完全失败。

7. 如果分选的细胞还需要进行培养，所有的器材和液体均应无菌。MACS分离过程应在超净工作台内完成操作。

8. 用作细胞功能实验时，最好用免疫磁性微珠阴性分离细胞，因为这些细胞未发生抗原抗体反应而基本上处于正常状态；而免疫磁性微珠阳性分离细胞，由于发生抗原抗体结合反应，可能导致细胞活化或凋亡，从而使细胞处于非正常状态，影响到细胞的功能状态。因此用免疫磁性微珠阳性分离细胞作功能实验时应十分谨慎。