简介
磁性细胞分选器分离（MACS）法即利用细胞表面标志，达到分离纯化 NK 细胞的目的。分离方式有阳性选择法和阴性选择法两种形式（具体操作参照实验时使用的试剂盒说明书）。
原理
磁性细胞分选器分离（MACS）法的基本原理是利用细胞表面标志，达到分离纯化 NK 细胞的目的。分离方式有阳性选择法和阴性选择法两种形式：
一、阳性选择法
人 NK 细胞的表型为 CD56＃-CD16＋CD3-CD19- CD14-CD15，在反应中加入 NK 细胞表面标志分子 CD16 抗体，该抗体为磁珠标记（此为直接法），使 NK 细胞与之特异结合形成磁性免疫复合物留于磁柱内。不表达 CD16 表面抗原分子的细胞由于不能与磁珠结合的特异性抗体结合，不能在磁场中停留，而被洗脱，因此能够分离和纯化 CD16＋的 NK 细胞。原理如下图 12-1。
二、阴性选择法
人 NK 细胞的表型为 CD56＃CD16＋CD3-CD19CD14 CD15，采用磁珠标记抗体的方法可以去掉人外周血中的 T 细胞（CD3＋）、B 细胞（CD19＊）以及单核细胞（CD14＊）。从外周血中分离出单个核细胞，以贴壁法去除其中的单核细胞后，用尼龙毛柱法去除其中的 B 细胞，余下的 T 细胞和 NK 细胞再与抗 CD3 标记的磁珠混合，使 T 细胞形成磁性复合物留于磁性分离柱内，未结合的细胞即为 NK 细胞。
材料与仪器
（一）阳性选择法
试剂：
（1）10％FCS-RPMI 1640 培养液。
（2）含 1％ 小牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (1%BSA-PBS)。
（3）鼠源性抗 CD16 单克隆抗体。
（4）羊抗小鼠 IgG 包被的磁珠。
仪器：
离心机、MS 柱及磁铁架
（二）阴性选择法
试剂：
（1）10％FCS-RPMI 1640 培养液。
（2）含 1％ 小牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (1%BSA-PBS)。
（3）抗 CD3、CD19 及 CD14 抗体。
（4）羊抗小鼠 IgG 包被的磁珠
仪器：
（1）离心机
（2）磁铁架
（3）MS 柱
步骤
一、阳性选择法的基本过程可分为以下几步：
（1）聚蔗糖-泛影葡胺法分离外周血单个核细胞。
（2）除去黏附的单核细胞和 B 细胞：用 10％FCS-RPMI 1640 调细胞浓度为 4x106／mL，加入无菌塑料平皿，37 ℃5％CO2 培养 2 小时。上清中剩余的 B 细胞和剩余的单核细胞，可采用尼龙毛柱分离法收集洗下的 T 细胞和 NK 细胞。
（3）磁珠分选 NK 细胞：上一步得到的 T 细胞和 NK 细胞混合液用磁珠分选法进行分离（具体参照试剂盒说明书）。
（4）取 1％BSA-PBS 10 mL，300 g 离心 8 分钟，洗涤 2 次。将上述细胞在 1.5 mL 离心管中重悬至 10／mL，置于 4 ℃ 备用。将抗 CD16 单抗加入细胞中（终浓度为 10 μg／mL），4 ℃ 或冰浴孵育 30 分钟。
（5）1％BSA-PBS 500 g 离心 1 分钟，洗涤 2 次。
（6）用 0.8 mL 1％BSA-PBS 将上述细胞在 1.5 mL 离心管中重悬，加入 200 μl 羊抗小鼠 IgG 包被的磁珠，4 ℃ 或冰浴孵育 30 分钟，并每 5 分钟混匀一次。
（7）1％BSA-PBS 500 g 离心 1 分钟，洗涤 2 次。1 mL 1％ BSA-PBS 离心管中重悬细胞，室温备用。
（8）将经 1％ BSA-PBS 预洗的 MS 柱安装于磁铁架上，加入上述制备的细胞悬液。待悬液全部流出后，用 1 mL PBS 轻洗 MS 柱 10 次。
（9）从磁铁架上取下分离柱，用 3 mL 1％BSA-PBS 冲洗磁珠结合的细胞，重复冲洗 3 次，300 g 离心 5 分钟，适量体积 1％BSA-PBS 重悬细胞，置于 4 ℃ 备用。
（10）流式细胞术检测细胞纯度及标记 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）或碘化丙啶（PI），检测细胞活力。
二、阴性选择法的基本过程可分为以下几步：
（1）分离外周血单个核细胞。
（2）除去黏附的单核细胞和 B 细胞：用 10％FCS-RPMI 1640 调细胞浓度为 4x106／mL，加入无菌塑料平皿，37 ℃5％CO2 培养 2 小时。上清中剩余的 B 细胞和剩余的单核细胞，可采用尼龙毛柱分离法收集洗下的 T 细胞和 NK 细胞。
（3）磁珠分选 NK 细胞：上一步得到的 T 细胞和 NK 细胞混合液磁珠分选法进行分离（具体参照试剂盒说明书）。
（4）取 1％BSA-PBS 10 mL，300 g 离心 8 分钟，洗涤 2 次。将上述细胞在 1.5 mL 离心管中重悬至 10／mL，置于 4 ℃ 备用。
（5）将抗 CD3、CD19 及 CD14 抗体加入细胞中（终浓度为 10 μg／mL），4 ℃ 或冰浴孵育 30 分钟。
（6）1％BSA-PBS 500 g 离心 1 分钟，洗涤 2 次。
（7）用 0.8 mL 1％BSA-PBS 将上述细胞在 1.5 mL 离心管中重悬，加入 200 μl 羊抗小鼠 IgG 包被的磁珠，4 ℃ 或冰浴孵育 30 分钟，并每 5 分钟混匀一次。
（8）1％BSA-PBS 500 g 离心 1 分钟，洗涤 2 次。1 mL 1％ BSA-PBS 离心管中重悬细胞，室温备用。
（9）将经 1％ BSA-PBS 预洗的 MS 柱安装于磁铁架上，加入上述制备的细胞悬液。收集流出液。
（10）流出液 300 g 离心 5 分钟，适量体积 1％BSA-PBS 重悬细胞，置于 4 ℃ 备用。
（11）流式细胞术检测细胞的纯度及标记 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）或碘化丙啶（PI），检测细胞活力。
注意事项
（1）使用前的磁珠，应充分洗涤以排除防腐剂及保护剂的干扰。
（2）每一步反应结合后的细胞收集，应充分洗涤防止抗体细胞之间的非特异结合。
（3）上分离柱前，特别是消化分离的贴壁培养细胞，应充分混匀，避免出现细胞团块。
（4）抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合，因此尽量使用新鲜分离的细胞。
（5）用分离柱分选，细胞悬液加入防止产生气泡，使分离柱不被气泡阻滞。
（6）分选细胞量应根据说明书推荐的使用范围，避免过多或过少。
（7）孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合。
来源：丁香实验
