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补体裂解法分离纯化自然杀伤细胞

相关实验:自然杀伤细胞的分离纯化

最新修订时间:

简介

NK 细胞功能研究首先涉及细胞的分离和纯化,该细胞多从人外周血以及小鼠脾脏单个核细胞中制备和分离,不同来源的 NK 细胞分离和纯化原理及过程相似。补体裂解法分离自然杀伤细胞主要根据 NK 细胞的比重(1.052~1.077 g/mL)、表型(CD56#-CD16+CD3-CD19-CD14-CD15)及生物学功能(无 MHC 限制性)等特点进行分离纯化。

原理

补体裂解法分离纯化自然杀伤细胞的基本原理是根据 NK 细胞的比重(1.052~1.077 g/mL)、表型(CD56#-CD16+CD3-CD19-CD14-CD15)及生物学功能(无 MHC 限制性)等特点进行分离纯化。

材料与仪器

试剂:


(1)C57BL/6 小鼠脾脏的单个核细胞。


(2)含 3% 胎牛血清的 Hanks 平衡液,RPMI 1640 完全培养基。


(3)10x 抗小鼠 CD4、CD8、I-A/I-Ed*及 CD24 单抗。


(4)抗大鼠免疫球蛋白 k 链单克隆抗体。


(5)兔血清补体(贮存于-70 ℃ 低温冰箱,需在使用前稀释使用)。


仪器:


(1)离心机


(2)显微镜


(3)流式细胞仪

步骤

补体裂解法分离小鼠脾脏 NK 细胞的基本过程可分为以下几步:


(1)将制备收集的小鼠脾脏单个核细胞重悬于含 3% 胎牛血清的 Hanks 平衡液(5x107/mL)中,冰浴。


(2)配制 10x 抗小鼠 CD4、CD8、I-A/I-E、CD24 单抗混合液。


(3)每 0.9 mL 细胞悬液中加入 0.1 mL 上述抗体混合液,于 4 ℃ 孵育 30 分钟。


(4)加入 10 mL 冰浴的 3% 胎牛血清 Hanks 平衡液轻轻混匀,于 4° C、200 g 离心 5 分钟,弃上清后,复洗一遍。


(5)将细胞重悬于含 3% 胎牛血清的 Hanks 平衡液(5x107/mL)。


(6)加入鼠抗大鼠 k 链单抗(终浓度 10 μg/mL)以及同等体积的兔补体。37 ℃ 温育 45 分钟,每 15 分钟轻摇一次。


(7)每管加入 10 mL 冰浴的 3% 胎牛血清的 Hanks 平衡液,混匀后 200 g 离心 10 分钟,弃上清,收集细胞。


(8)加入 5 mL 冰浴的 3% 胎牛血清的 Hanks 平衡液,混匀。取少量细胞通过锥虫蓝染色检查细胞活力。


(9)按上述 Percoll 不连续密度梯度分离 NK 细胞方法,进一步纯化分离的小鼠 NK 细胞,通过流式细胞仪检测表型来鉴定 NK 细胞的纯度。

注意事项

(1)通过此法制备的细胞悬液中含有死细胞,可以通过密度梯度离心去除这些细胞。


(2)最佳补体浓度与细胞浓度需要通过预实验确定。


(3)制备人 NK 细胞时,可预先通过尼龙棉柱去除其中的 B 细胞及辅佐细胞,然后通免疫磁珠去除其中的 T 细胞等,最终得到富集的 NK 细胞。


(4)如制备高纯度小鼠或人 NK 细胞以及 NK 细胞亚群,建议采用免疫磁珠法或通过流式细胞仪直接进行分选。

来源:丁香实验

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