补体裂解法分离纯化自然杀伤细胞

NK 细胞功能研究首先涉及细胞的分离和纯化，该细胞多从人外周血以及小鼠脾脏单个核细胞中制备和分离，不同来源的 NK 细胞分离和纯化原理及过程相似。补体裂解法分离自然杀伤细胞主要根据 NK 细胞的比重（1.052～1.077 g／mL）、表型（CD56＃-CD16＋CD3-CD19-CD14-CD15）及生物学功能（无 MHC 限制性）等特点进行分离纯化。

补体裂解法分离纯化自然杀伤细胞的基本原理是根据 NK 细胞的比重（1.052～1.077 g／mL）、表型（CD56＃-CD16＋CD3-CD19-CD14-CD15）及生物学功能（无 MHC 限制性）等特点进行分离纯化。

试剂：

（1）C57BL／6 小鼠脾脏的单个核细胞。

（2）含 3％ 胎牛血清的 Hanks 平衡液，RPMI 1640 完全培养基。

（3）10x 抗小鼠 CD4、CD8、I-A／I-Ed＊及 CD24 单抗。

（4）抗大鼠免疫球蛋白 k 链单克隆抗体。

（5）兔血清补体（贮存于-70 ℃ 低温冰箱，需在使用前稀释使用）。

仪器：

（1）离心机

（2）显微镜

补体裂解法分离小鼠脾脏 NK 细胞的基本过程可分为以下几步：

（1）将制备收集的小鼠脾脏单个核细胞重悬于含 3％ 胎牛血清的 Hanks 平衡液（5x107／mL）中，冰浴。

（2）配制 10x 抗小鼠 CD4、CD8、I-A／I-E、CD24 单抗混合液。

（3）每 0.9 mL 细胞悬液中加入 0.1 mL 上述抗体混合液，于 4 ℃ 孵育 30 分钟。

（4）加入 10 mL 冰浴的 3％ 胎牛血清 Hanks 平衡液轻轻混匀，于 4° C、200 g 离心 5 分钟，弃上清后，复洗一遍。

（5）将细胞重悬于含 3％ 胎牛血清的 Hanks 平衡液（5x107／mL）。

（6）加入鼠抗大鼠 k 链单抗（终浓度 10 μg／mL）以及同等体积的兔补体。37 ℃ 温育 45 分钟，每 15 分钟轻摇一次。

（7）每管加入 10 mL 冰浴的 3％ 胎牛血清的 Hanks 平衡液，混匀后 200 g 离心 10 分钟，弃上清，收集细胞。

（8）加入 5 mL 冰浴的 3％ 胎牛血清的 Hanks 平衡液，混匀。取少量细胞通过锥虫蓝染色检查细胞活力。

（1）通过此法制备的细胞悬液中含有死细胞，可以通过密度梯度离心去除这些细胞。

（2）最佳补体浓度与细胞浓度需要通过预实验确定。

（3）制备人 NK 细胞时，可预先通过尼龙棉柱去除其中的 B 细胞及辅佐细胞，然后通免疫磁珠去除其中的 T 细胞等，最终得到富集的 NK 细胞。