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不连续密度梯度分离法

相关实验:自然杀伤细胞的分离纯化

别名:Percoll 密度梯度分离法

最新修订时间:

简介

Percoll 是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒,渗透压低(<20 mOsmol/kgH20),黏度小,形成的梯度非常稳定,可高达 1.3 g/mL 密度。采用预先形成的密度梯度可在低离心力(200~1000 g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。而且 Percoll 不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

原理

不连续密度梯度分离法(Percoll 密度梯度分离法)的基本原理是利用一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒 Percoll,其渗透压低(<20 mOsmol/kgH20),黏度小,形成的梯度非常稳定,可高达 1.3 g/mL 密度。采用预先形成的密度梯度可在低离心力(200~1000 g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。

用途

不连续密度梯度分离法(Percoll 密度梯度分离法)常用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

材料与仪器

试剂:


1. pH 7.2 柠檬酸盐缓冲液


2. 聚蔗糖-泛影葡胺分层液(Ficoll-Hypaque,密度 1.077±0.001,商品名为淋巴细胞分离液)


3.Percoll 细胞分离液。


仪器:


1. 离心机


2. 混匀仪

步骤

不连续密度梯度分离法(Percoll 密度梯度分离法)的基本过程可分为以下几步:


(1)分离外周血单个核细胞:采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离外周血中的单个核细胞。


(2)不同浓度(密度)Percoll 溶液的制备:


1)用 9 份 Percoll 与 1 份 8.5%NaCl 或 10xPBS 混合达到生理性渗透压(285mOsmol/kgH20)


2)用生理溶液(0.85%NaCl 或 1xPBS 稀释到所需的不同浓度。

一般情况下需配制 7 种不同浓度的 Percoll 分层液,范围为 40%~57.5%,每梯度相差 2.5%,即 57.5%、55%、52.5%、50%、47.5%、45%、42.5%、40%。


(3)将不同密度的 Percoll 按照从高密度至低密度,每层 Percoll 悬液约 1.2~1.5 mL,按顺序依次加入到 15 mL 离心管中,注意不要打破不同浓度之间的界面。最后加入 1 mL 细胞悬液于 Percoll 分层液的顶部(细胞浓度约为 1x10 细胞/mL),2000 r/min(400 g),室温离心 35 分钟。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置,当相邻两层 Percoll 比重相差不大时,可将 Percoll 液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。


(4)富含 NK 细胞位于 42.5% 与 45.0%Percoll 界面以及上下二层的 Percoll 液中,用滴管吸取 NK 细胞层到新的离心管中。当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时,可逐层去除 Percoll 液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于 Percoll 层中,则需逐层收集。


(5)收集含有 Percoll 液的细胞用 PBS 液洗细胞 400 g,室温离心 10 分钟,重复 3 次。


(6)用 10% FCS-RPMI 1640 培养液重悬细胞,4 ℃ 保存,24 小时之内使用。


(7)用荧光标记的抗 CD3、CD56 及 CD16 标记细胞,流式细胞术测定细胞纯度。

注意事项

(1)采用新鲜血液标本,抽取人外周静脉血及整个细胞分离过程要注意无菌操作,分离操作应在 18~20 ℃ 进行。人体血液标本有潜在的生物安全性问题,需注意实验防护。


(2)操作全程应尽可能短时间内完成,以保持细胞活力。


(3)样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。


(4)由于多层 Percoll 之间密度差别不大,因此离心机加速、降速时要慢且平稳,以保持清晰稳定的界面。

来源:丁香实验

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