不连续密度梯度分离法

Percoll 是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，渗透压低（＜20 mOsmol／kgH20），黏度小，形成的梯度非常稳定，可高达 1.3 g／mL 密度。采用预先形成的密度梯度可在低离心力（200～1000 g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于 Percoll 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。而且 Percoll 不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

不连续密度梯度分离法（Percoll 密度梯度分离法）的基本原理是利用一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒 Percoll，其渗透压低（＜20 mOsmol／kgH20），黏度小，形成的梯度非常稳定，可高达 1.3 g／mL 密度。采用预先形成的密度梯度可在低离心力（200～1000 g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。

不连续密度梯度分离法（Percoll 密度梯度分离法）常用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

试剂：

1. pH 7.2 柠檬酸盐缓冲液

2. 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll-Hypaque，密度 1.077±0.001，商品名为淋巴细胞分离液）

3.Percoll 细胞分离液。

仪器：

1. 离心机

不连续密度梯度分离法（Percoll 密度梯度分离法）的基本过程可分为以下几步：

（1）分离外周血单个核细胞：采用聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）分离外周血中的单个核细胞。

（2）不同浓度（密度）Percoll 溶液的制备：

1）用 9 份 Percoll 与 1 份 8.5％NaCl 或 10xPBS 混合达到生理性渗透压（285mOsmol／kgH20）

一般情况下需配制 7 种不同浓度的 Percoll 分层液，范围为 40％～57.5％，每梯度相差 2.5％，即 57.5％、55％、52.5％、50％、47.5％、45％、42.5%、40%。

（3）将不同密度的 Percoll 按照从高密度至低密度，每层 Percoll 悬液约 1.2～1.5 mL，按顺序依次加入到 15 mL 离心管中，注意不要打破不同浓度之间的界面。最后加入 1 mL 细胞悬液于 Percoll 分层液的顶部（细胞浓度约为 1x10 细胞／mL），2000 r／min（400 g），室温离心 35 分钟。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，当相邻两层 Percoll 比重相差不大时，可将 Percoll 液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

（4）富含 NK 细胞位于 42.5％ 与 45.0％Percoll 界面以及上下二层的 Percoll 液中，用滴管吸取 NK 细胞层到新的离心管中。当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除 Percoll 液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于 Percoll 层中，则需逐层收集。

（5）收集含有 Percoll 液的细胞用 PBS 液洗细胞 400 g，室温离心 10 分钟，重复 3 次。

（6）用 10％ FCS-RPMI 1640 培养液重悬细胞，4 ℃ 保存，24 小时之内使用。

（1）采用新鲜血液标本，抽取人外周静脉血及整个细胞分离过程要注意无菌操作，分离操作应在 18～20 ℃ 进行。人体血液标本有潜在的生物安全性问题，需注意实验防护。

（2）操作全程应尽可能短时间内完成，以保持细胞活力。

（3）样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。