不连续密度梯度分离法分离NK细胞

PNK细胞即自然杀伤细胞，是一群具有自然杀伤能力的大颗粒淋巴细胞，无粘附作用。它们不需要抗原激活，也没有MHC限制性，即能直接杀伤肿瘤细胞。成熟的NK细胞离开骨髓进入外周免疫器官，主要分布在脾脏和外周血中，约占外周血的3%。

试剂及配制

1. pH 7.3柠檬酸缓冲液：柠檬酸 327mg；柠檬酸钠 2.63g；碳酸氢钠 222mg；葡萄糖 2.55mg；蒸馏水加到 100ml

2. 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）

3. Percoll(Pharmacia)产品

4. Hank’s液(含5%小牛血清)

操作方法

1. 外周血单个核细胞的分离

①将外周抗凝血与柠檬酸缓冲液按7:1比例混合；

②离心，1000r/min，10min，弃上清，注意勿触及细胞沉淀；

③用吸管小心吸取细胞沉淀上面富含白细胞的部分；

④以3倍体积的Hank’s液稀释细胞，置于聚蔗糖-泛影葡胺分层液上，离心，2000r/min，20min；

⑤小心吸取界面白细胞部分，用Hank液洗2次，配成0.5～1×108/ml。

2. 非连续Percoll密度梯度离心

①将Percoll渗透压调整到285mOsmol/kgH2O；

②制备7种不同的Percoll分层液,范围为40%～57.5%,每梯度相差2.5%，即40%、42.5%、45%、47.5%、50%、52.5%、55%、57.5%；

③将不同梯度的Percoll轻轻地一层层铺起，从高度密度至低密度加，最后加1ml细胞悬液于顶部；

④离心，2000r/min，30min；

⑤小心地吸取第二、三部分的细胞。第一部分是顶部液体与40% Percoll之间，第二部分是40%与42.5%Percoll之间，第三部分是42.5%与45%的Percoll之间，这两部分富含NK细胞；

⑥用Hank’s液洗2次，1000r/min，10min，细胞重悬于Hank液中，4℃存放备用。

结果观察

通过形态学分析，Percoll密度梯度离心分离的NK细胞80%为大颗粒淋巴细胞，细胞活力95%。

鉴定

CD56、CD57单抗间接免疫荧光发鉴定纯度，台盼蓝拒染法测存活率。

注意事项

1. 血标本应新鲜，宜在4℃下分离细胞，以保持细胞活力。

2. 一般用柠檬酸盐抗凝，可能柠檬酸盐能更有效阻断补体系统在体外活化。