密度梯度细胞分离法

制备密度梯度液，通过密度梯度液离心细胞，收集各梯度组分，用培养基稀释，培养细胞。

细胞样品
D-PBS 0.25%胰蛋白酶
生长培养基 生长培养基+20% Percoll 25ml离心管 注射器或梯度收集器 24孔培养板 折光仪或密度计 低速离心机

通过下述方法之一制备密度梯度液：

(a)分层铺放法：

(i)调整 Percoll 密度至 1.10 g/CC，渗透压为 290 mOsm/kg 。

(ii)将 Penroll 与不同比例的常规培养基混合达到所需的密度范围（例如，1.020~1.100 g/ml )， 一般为 10 或 20 个级差。

(iii)在 25 ml 离心管中，用吸管、注射器和蠕动泵，每个密度取 1 ml 或 2 ml，从最高密度起，逐层地将一种密度液铺放在另一层上，建立起一种阶梯性密度梯度。也可以从低密度铺起，用注射器或蠕动泵，将髙一级密度的溶液注射到上一级的下面。后一种方法也许更可取。

密度梯度液可以立即使用或放置过夜。

(b)使用梯度形成器：

一种连续性的线性梯度可以在梯度形成器里通过混合不同浓度的 Percoll 而实现。例如，在梯度发生器里混合 1.020 g/ml 及 1.080 g/cc 的 Percoll（Fisons、Pharmacia、Buchler）。



(c)离心法：

(i)在离心管中加人含密度为 1. 085 g/cc Percoll 的培养基。

(ii)20000 g 离心 1 h 。

(iii) 离心产生一个 S 型的密度梯度，其形状是由 Percoll 的初始浓度、离心时间、离心力、离心管形状以及离心方式所决定的。



1. 胰蛋白酶消化细胞，重新悬浮于加了血清或胰蛋白酶抑制剂的培养基中，确保是单细胞悬液。

2. 用一个注射器，移液管或末端纤细的吸管将含 2x10⁷ 个细胞的 2 ml 细胞悬液小心平铺在梯度液的顶端。

3. 离心管直立在台面上 4 h，让细胞在 1 g 的状态下自由沉降，或者在 100~1000 g 之间离心 20 min。如果用后一种方法，要在离心开始时逐渐地加大离心速度，并且在离心快要结束时不要人为制动。

4. 用一个注射器或梯度收集器（Fisons ) 收集细胞。1 ml 的最可以收集到一个 24 孔培养板中，0.1 ml 的量则收集于一个微滴定板上。每间隔一定时间应当取样进行细胞计数及梯度液的密度（β）测定。密度测定可以使用折光仪（Hilger） 或密度计（Paar）。

5. 每孔加入等体积的培养基，混匀以保证细胞能接触孔的底部。培养 24~48 h 后，更换培养基以除去 Percoll。