磁化细胞分离器分离法（MACS）分离NK细胞

从外周血分离单个核细胞，以粘附法除去其中的单核细胞后，以尼龙棉柱法除去其中的B细胞，余下的T细胞和NK细胞以磁化细胞分离器(MACS)进行分离。

有两种方法：

阴性选择法，在反应中加入抗CD3抗体，使T细胞与之特异结合后形式磁性分离柱内，以除去标记的T细胞，洗下的未标记细胞；

阳性选择法，在反应中加入抗CD16及抗CD56，使NK细胞与之特异结合形成磁性免疫复合物留于柱内，将未标记细胞洗去后，将标记的NK细胞以洗液轻轻加压洗脱。

试剂及配制

1. 含10%血清PRMI-1640液

2. 含1%小牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（1% BSA/PBS）：作为抗体稀释液和洗涤液。

3. 抗 CD3单克隆抗体

4. 抗CD16单克隆抗体：CD16为人NK细胞表面的一种分化抗原。

5. 抗CD56单克隆抗体：CD56亦为人NK细胞表面的一种分化抗原。

6. 生物素标记的羊抗鼠血清

7. 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的链霉亲和素

8. 生物素标记的磁球颗粒

操作方法

1. 分离外周血单个核细胞（PBMC）：见聚蔗糖-泛影葡胺分离法。

2. 将单个核细胞的浓度用含10%血清RPMI-1640调整为4×106 /ml，加入到无菌的塑料平皿中，37℃，7.5%CO2 环境中培养2h后，除去粘附于塑料的单核细胞和B细胞；

3. 非粘附细胞与含10%血清RPMI-1640液预孵育1h后过尼龙棉柱，B细胞和剩余的单核细胞粘附在尼龙棉柱上，用培养液洗柱，收集洗下的T细胞和NK细胞；

4. 用磁场分离T细胞和NK细胞：以无菌操作标记和分离细胞。新分离的T细胞和NK细胞在水浴中进行标记，细胞先与抗表面抗原的单抗孵育10min（107 个细胞用100ul抗CD3单抗或25ul抗CD16单抗或抗CD56单抗），细胞经洗涤后与生物素标记的100ul羊抗鼠抗血清孵育10min，洗涤后加入FITC标记的链霉亲和素25ul，反应8min，洗涤后加生物素标记的磁颗粒（加抗CD3单抗者加100ul磁颗粒，加25ul抗CD16单抗或抗CD56单抗者加50ul磁颗粒）反应8min。

上述每步反应后，均以10倍体积的含1%牛血清白蛋白的PBS洗涤，3000r/min离心8min，以终止反应。使用磁化细胞分离器(MACS)作免疫磁性分离。分离柱在使用前以高压灭菌。

5. 将标记有磁性复合物的细胞悬液重悬于2～5ml含1%牛血清白蛋白的PBS中，调其细胞浓度为5×107 ～1×108 细胞/ml。将分离柱先与含1%牛血清白蛋白的PBS预孵育30min，4℃预冷后放入永久性磁铁的磁场中，将标记细胞悬液加80～100ml。将分离柱拿出磁场，用50ml洗液在无菌条件下以注射器轻轻加压洗脱标记的细胞，离心沉淀细胞，用荧光显微镜分析，用台盼蓝估计存活率，以RPMI-1640液保存。

注意事项

NK细胞为CD16+、CD56+、CD3-细胞。若反应中加入了抗CD3单抗，则洗脱的未标记细胞为NK细胞；约反应中加入了抗CD16、抗CD56单抗，则柱中保留的标记细胞为NK细胞。前一种方法为阴性选择法，后一种方法为阳性选择法。