电泳分离法

最新修订时间：2024-05-13

原理

乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase, 简称为LDH) EC ( 1 ,1 , 1 . 2) 存在于一切有糖酵解作用的细胞中, 在NAD⁺存在下催化乳酸脱氢形成丙酮酸或使丙酮酸还原成乳酸。其酶蛋白是由四个亚基组成的四聚体, 亚基有心脏型( H 型) 及肌肉型( M型) 两种。根据酶蛋白四聚体中H 型和M 型亚基比例的差别,可将LDH 同工酶分为五种, 即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。亚基分子量相似, 为35000左右, 但带电荷情况不同,因此在电泳时有不同的电泳速度。本实验系用琼脂糖凝胶作支持介质, 在pH8 . 6 的巴比妥缓冲液中电泳, 将LDH 同工酶分离。以乳酸为底物, 在氧化型辅酶I 存在时, LDH 可使乳酸脱氢生成丙酮酸, 使NAD⁺还原成NADH₂ , NADH₂ 又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐( PMS ) ,PMS 再将氢传给氯化硝基四唑蓝(NBT ) , 使其还原为蓝紫色化合物。因此, 有LDH 活性的区带即着蓝紫色。

材料与仪器

乳酸脱氢酶
琼脂糖巴比妥缓冲液蒸馏水乳酸钠溶液氯化硝基四唑蓝水溶液氧化型辅酶Ⅰ 吩嗪二甲酯硫酸盐醋酸溶液尿素水溶液
电泳槽电泳仪恒温培养箱冰箱

步骤

1 . 凝胶板的制作: 将电泳洗净、干燥, 两边用胶带封口,选好梳子并装好, 调节水平, 浇已熔化好的0 . 7%琼脂糖凝胶适量, 冷至凝固, 然后移至4 ℃冰箱中放置30～50 min 后使用。

2 . 点样及电泳: 将电泳缓冲液加到槽中刚好盖上凝胶, 用微量取样器加20 μl 血清样品(样品中或加入溴酚蓝指示剂) , 按4～5 mA/ cm 胶宽调节电流, 电泳大约40～50 min , 直至血清白蛋白( 或溴酚蓝指示剂) 距胶终点1～2 cm 时停止电泳( 如果室温比较高就在冰箱中电泳)。

3 . 显色: 将电泳后的凝胶放于带盖培养皿中, 用毛细滴管加显色剂均匀铺凝胶上一薄层, 然后平放于37 ℃ 恒温培养箱中避光保温60 min , 使同工酶各区带充分显色。

4 . 固定: 将显色后的凝胶板放入10%冰乙酸水溶液中固定10 min , 倾去固定液, 蒸馏水漂洗2次, 洗去多余的显色液。

5 . 定量分析: 漂洗后的胶板, 用刀割下各区带, 分别移入已放有3 ml 25%尿素水溶液的试管内, 混合, 置沸水中10 min ,待凝胶全部熔化后, 移至37 ℃水浴中冷却10 min 后比色。722分光光度计, 波长560 nm, 蒸馏水调零, 记录各区带光密度值。计算各区带的百分含量。计算方法为: 各区带光密度值除以各区带光密度之和乘以100%。

注意事项

1. 在LDH 同工酶显色后, 往往在LDH1 前沿有一块桃红色的非特异性显色区域, 这不是LDH1 的组成部分, 定量时应去掉。

2. 溶血标本对结果有明显影响, 不能采用。

3. 本法也适用于各种体液LDH 同工酶测定。

来源：丁香实验