Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

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　　(一)　原理

　　Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

　　(二)操作方法及注意事项

　　1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS 混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

　Percoll浓度(％)　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20

　　比重g／ml　　　1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031

2.　不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

　　3.　装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

　　4.　离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机 加速、降速时要慢，要平稳。

　　5.　取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

　　(三)分离纯化细胞举例

　　1.　富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

　　2.　纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原 、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

　　(四)　人不同血细胞的漂浮密度

　　　　　　　　　　表　　　人不同血细胞的漂浮密度

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　　　细　胞　　　漂浮密度　　　　│ 细　胞　　　　　　　漂浮密度

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　　　红细胞　　1.09-1.11　　　　│淋巴细胞　　　　　　　1.052-1.077

　　　粒细胞　　　　　　　　　　 │ B淋巴细胞　　　　　 1.062-1.075

　　　嗜酸性　　1.09-1.095　　　 │ T淋巴细胞　　　　　 1.065-1.077

　　　嗜中性　　1.080-1.085　　　│ 淋巴母细胞　　　　　1.065-1.077

　　　单核细胞　1.050-1.066　　　│自然杀伤细胞　　　　　1.050-1.070

　　　血小板　　1.030-1.060　　　│

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