人骨髓不连续密度梯度离心用于MSCs生产

(a)去除抗凝管盖子，将骨髓液转移至50mL离心管中。加人室温的HBSS,确保体积达到25 mL。

(b)取另一个50 mL离心管，加人20 mL Ficoll-Paque淋巴细胞分离液，将25 mL细胞悬液轻轻加到Ficoll上层。HBSS与Ficoll间的界面不能被破坏。

(c)关闭闸，室温1800g离心30min。

(d)离心完毕，于Ficoll和HBSS的界面收集白色细胞层,将其移至新的50 mL离心管中。

(e)用HBSS将收集到的细胞悬液体积调至3倍，室温1000g离心10 min。重复洗涤。

(f)用30 mL预热至37℃的CCM重悬细胞

(g)取10μL细胞悬液加入到10μL台盼蓝中，血细胞计数器评价细胞的存活率，存活率需高于80%。

(h)将30mL细胞悬液移至直径15 cm组织培养皿中，于5% C0₂培养箱中培养至少15h。

(i)从培养箱中取出培养皿，吸出培养基。

(j)加入20 mL预热的PBSA,润洗单层细胞，弃去。

(k)重复润洗过程3次。

(l)加人30 mL预热的新鲜CCM。

(m)每隔一天重复此润洗和更换培养基操作，共6天。

(n)6天后，在倒置显微镜下观察单层细胞，贴壁的、成纤维细胞样MSCs克隆在培养皿中清晰可见。有时可能有造血细胞污染的迹象，但这些细胞可以在传代时被去除。培养物达到50%〜60%汇合时，进行扩增和冻存处理。

完全培养基（CCM)：α-MEM: α低限量基础培养基 含谷氨酰胺 无核苛酸或脱氧核苷酸；添加：附加L-谷氨酰胺2 mmol/L(终浓度 包含组分内的谷氨酰胺共4 mmol/L)，20%经FBS杂交瘤纯化 非热灭活，青霉素100 U/mL，链霉素100μg/mL。过滤除菌 储存于4℃ 不超过2周。