电镜观察法检测细胞凋亡

最新修订时间：2022-02-10

简介

凋亡细胞除染色质发生变化外，其亚细胞结构也出现相应的变化，如核破裂，形成电子密度增强的膜包体；细胞膜芽生出泡，凋亡小体形成等。这些变化在分辨率较高的电子显微镜下能很好显示。此外，透射电子显微镜样品的固定、脱水及切片厚度均与光镜不同。

原理

电镜观察法检测细胞凋亡的基本原理是电子显微镜使用电子束来对样品成像，将分辨率自光镜的 0.2 μm 提高到约 0.2 nm，可为细胞死亡类型提供最确切的证据。电子束与样品中的原子相互作用可产生弹性散射和非弹性散射，弹性散射和非弹性散射联合作用产生了最终的图像。用铅、铀和锇等重金属对生物样品的特定区域进行染色，可以增加该区域的弹性散射，加强图像的对比度。

材料与仪器

器材：

染缸、10 ml 的锥形离心管、500 ml 锥形瓶、塑料棒蕊、胶囊、10 ml 吸管、吸管橡皮球、微波炉、离心机、恒温烤箱、超薄切片机、透射电镜、已诱导凋亡的细胞。

试剂：

① 消化液（0.02% EDTA）

② PBS

③ 蒸馏水

④ 琼脂糖

⑤ 乙醇-树脂（1:1）

⑥ 树脂

⑦ 醋酸铀-柠檬酸铅

⑧ 4% 多聚甲醛/ 0.1 mol/L 磷酸缓冲液

⑨ 1% 锇酸（二甲胂酸钠缓冲液配制）

⑩ 梯度乙醇

⑪ 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（储备液）甲液：磷酸氢二钠 Na₂HPO₄·2H₂O 35.61 g 加蒸馏水至 1000 ml；乙液：磷酸二氢钠 Na₂HPO₄·2 H₂O 27.60 g 加蒸馏水至 1000 ml。

⑫ 工作液（pH7.2）甲液（36.0 ml）＋乙液（14.0 ml）总 50 ml。

⑬ 工作液（pH7.4）甲液（40.5 ml）＋乙液（9.5 ml）总 50 ml。

步骤

电镜观察法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：

A 制备琼脂离心管用蒸馏水将琼脂配成 20 g/L 溶液，加热溶解。灌入一 10 ml 的锥形离心管，其中央竖放一下端尖细的棒蕊，凝固后抽出棒蕊，备用。

B 收集细胞将消化的贴壁细胞放入离心管，1000 r/min 离心 5 min，弃上清液，用冷 PBS（4 ℃）洗，5 ml PBS 悬浮细胞并将其加入琼脂离心管。2000 r/min 离心 15 min，弃上清液。

C 加入适量的 4% 多聚甲醛固定 15 min 后取出离心管中的琼脂块，用刀修出含细胞团的琼脂块（可放入含 4% 多聚甲醛的小瓶，在 4 ℃ 下长期保存）。

D PBS（4 ℃）洗 3 x 5 min。

E 1% 锇酸（4 ℃）固定 30 min。

F 蒸馏水（4 ℃）洗 3 x 5 min。

G 脱水 30% 乙醇、50% 乙醇、70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、100% 乙醇（I）和 100% 乙醇（II）各 2 min。

H 浸透 1:1 的乙醇：树脂 60 min，100% 的树脂 2 x 60 min。

I 包埋将胶囊放置 60 ℃ 恒温烤箱 2 h，将包埋剂灌入胶囊并放置标签；将细胞团的琼脂块移至胶囊的中央，静置，使其自然沉降至胶囊的底部后，置于 60 ℃ 恒温烤箱 48 h。

J 切片。

K 醋酸铀-柠檬酸铅染色。

L TEM 下观察。

注意事项

多聚甲醛、二甲胂酸钠、锇酸：吸入、摄入或经皮肤吸收有毒。提示实验人员相关操作应戴手套及防护镜，在化学通风橱进行。

来源：丁香实验