Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡

试剂：

① 含 10％FBS 的 RPMI 1640 培养液；

② 放线菌素 D（dactinomycin D）。

③ 20 μg/ml 1 Hoechst 33258 PBS 溶液。

Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步，本方法以检测 K562 细胞凋亡为例介绍 Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡：

A. 实验分组 凋亡组：收集培养的 K562 细胞，调细胞密度为 1x10⁶/ml。于 24 孔培养板中加 K562 细胞液 1 ml，加入放线菌素 D，加 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液，放线菌素 D 终浓度为 10 μg/ml，总体积 2 ml。于 37℃、5％ CO₂ 细胞培养箱培养。阴性对照组，培养液不加放线菌素 D。

B. 细胞置 CO₂ 培养箱中培养 8 小时。在倒置显微镜下直接观察细胞凋亡情况。细胞凋亡后，收集细胞，以 800 g 离心 10 分钟，弃上清，余液重新悬浮后涂片，室温晾干。甲醇固定 1 分钟，晾干。

C. 细胞涂片用 PBS 浸泡 3 分钟，滴加 Hoechst 33258 染液 3 滴，室温避光染色 10 分钟，用水洗涤 3 次，每次 3 分钟。最后用 50％ 甘油封片，在荧光显微镜下观察细胞形态变化并拍照。

1. Hoechst 33258 为荧光染料，易淬灭。染色及洗涤过程应尽量避光。在显微镜下观察时应尽量缩短观察时间。

2. 如果有条件，可以在封片剂中加抗荧光淬灭剂以延长荧光显示时间。