苏木精-伊红染色法检测细胞凋亡

器材：CO₂ 培养箱、生物安全柜、正视显微镜及离心机等。

试剂：

① 喜树碱；

② 含 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液；

③ 苏木精、伊红、乙醇及二甲苯等，为分析纯级产品；

④ 苏木精染液的配制 A 液：苏木精 1 g、无水乙醇 10 ml；B 液：甲矾 20 g、蒸馏水 200 ml；C 液：高锰酸钾 1 g、蒸馏水 16 ml。三种溶液溶化后，将 A 液倒入 B 液，再加进 C 液 3 ml，充分搅拌均匀后，加热至煮沸 2 分钟，迅速冷却。此液配后即可使用，染色后无需碱化细胞核即成蓝色。

⑤伊红染液的配制（1％）（伊红 Y1 g，冰醋酸 200μl，75％ 乙醇定容，终体积为 100 ml）。

⑥分化液的配制（100 ml70％ 乙醇中加入 1 ml 浓盐酸，即 1％ 的盐酸乙醇分化液）。

苏木精-伊红染色法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步，本方法以检测喜树碱诱导 Jurkat 细胞凋亡为例介绍苏木精-伊红染色法检测细胞凋亡：

A. 实验分组 凋亡组，收集培养的 Jurkat 细胞，调细胞密度为 1x10/ml，于 24 孔细胞培养板中加 Jurkat 细胞液 1 ml，加入喜树碱溶液，补加含 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液，使喜树碱终浓度为 300ng/ml，总体积 2 ml。于 37℃、5％ CO₂ 的细胞培养箱中培养；阴性对照组，细胞培养液不加喜树碱。

B. 细胞置 CO₂ 培养箱中培养 12 小时后，在倒置显微镜下直接观察细胞凋亡情况。细胞凋亡后，收集细胞以 800 g 离心 10 分钟，弃上清。加 100μl 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液，细胞经重新悬浮后涂片，室温晾干。甲醇固定 1 分钟，晾干。

C. 细胞涂片用苏木精染液染色 10-20 分钟，低压水流洗去浮色。1％ 盐酸乙醇分化 2-10 秒，用 1％ 氨溶液浸泡 5 分钟后，再用自来水冲洗 10 分钟。

D. 伊红染液染色 5 分钟，用低压水流冲洗 5 分钟。经梯度脱水透明后，以中性树脂封片后镜下观察拍照。

1. 载玻片要用经过多聚赖氨酸等处理过的片子，避免细胞脱片。

2. 应根据染色效果具体确定苏木精及伊红染液染色时间。

3. 染色后的盐酸分化是影响染色效果的另一重要环节，分化时间也应根据观察效果确定。

4. 其他能对细胞质及细胞核着色的方法也能用于观察分析细胞凋亡，如瑞氏-吉姆萨染色法可达到相同的实验效果。