简介
运用物理或化学方法将外源 DNA 导入细胞的过程，称为 DNA 转染或基因转染(transfection)。采用该技术,既可将外源基因导入体外生长的细胞，用于研究基因的表达调控，亦可将外源基因导入体内细胞，用于基因治疗。
脂质体转染法操作简单，无需昂贵的仪器设备，成本较低，已被许多实验室广泛采用。
原理
脂质体转染法的原理是脂质体(liposomes)是由脂质双分子层组成的、内部为水相的闭合囊泡结构。在脂质体的水相和膜内可包裹多种物质。DNA 与脂质体混合后可被包裹在脂质体的水相中。当脂质体与转染细胞的细胞膜相接触时，其脂质双分子层与细胞膜融合，脂质体水相中 DNA 进入细胞内部，细胞被转染。
材料与仪器
器材:
① 1.5 ml Eppendorf 管
② 20 μl 微量移液器
③ 100 μl 微量移液器
④ 2 ml 移液器
⑤吸头、吸管、吸水滤纸
⑥CO2 培养箱
⑦倒置显微镜
⑧荧光显微镜(450~490 nm)
⑨离心机、天平
试剂:
①材料:35 mm 培养皿培养的 HeLa 传代细胞、无血清 MEM 培养液稀释的 pCMV-GFP 质粒 DNA(2 μg / 100 μl)、无血清 DMEM 培养液稀释的脂质体 Lipofectin(2 μg/μl)
②无血清 DMEM 培养液
③胰蛋白酶溶液
④含 10% 小牛血清的 MEM 完全培养液
步骤
脂质体转染法的基本过程可分为如下几步:
(1)转染前 24 h，用胰蛋白酶溶液消化收集 HeLa 细胞培养物，以 5x104 个/平皿的细胞密度平铺细胞于 35 mm 组织培养皿上，加入 3 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养基置于 5%~7% CO2 的 37℃ 温箱内孵育。
(2)配制溶液 A 和溶液 B。溶液 A：取 2 μg pCMV-GFP 质粒 DNA 用 100 μl 无血清无抗生素培养液稀释(2 μg / 100 μl)。溶液 B：取 20 μl 脂质体 Lipofectin(2 μg/μl)用 100 μl 无血清无抗生素培养液稀释。
(3)室温下孵育 10 min。
(4)将溶液 A 逐滴加入溶液 B 中，用吸管吹打几次混匀，并于室温下孵育 10 min。
(5)取出 HeLa 细胞培养皿，用无血清培养液将培养皿内细胞反复洗涤(400 g，离心 3 min，弃上清液)3 次。最后，加入 0.5 ml 无血清培养液，暂置于 5%~7% CO2 的 33℃ 温箱内孵育。
(6)DNA- 脂质体混合液孵育 10 min 后，取 0.8 ml 无血清培养液加入混合液中，混匀，室温下再孵育 10 min。
(7)将孵育后的 DNA- 脂质体混合液移至 HeLa 细胞培养皿中，置于 5%~7% CO2 的 33℃ 温箱内孵育 5 h。
(8)取出 HeLa 细胞培养皿，再用无血清的培养液将培养皿内细胞反复洗涤(400 g，离心 3 min，弃上清液)3 次。最后，加入 3 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养基，置于 5%~7% CO2 的 33 ℃ 温箱内孵育 24~48 h。
(9)24 h 后，在 450~490 nm 波长的光下用荧光显微镜观察 HeLa 细胞的转染率和荧光强度。
(10)记录、分析实验结果。
注意事项
(1)传代细胞的准备细胞在转染前 24 h 传代，待细胞密度达 60%~75% 满皿底时即可进行转染。如果转染前细胞生长不足 12 h，细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。
(2)用 Lipofectin 转染时，不要用聚丙烯试管，因为 Lipofectin 中的阳离子脂类会与聚丙烯发生非特异性结合，而影响转染结果。
(3)在添加 DNA- 脂质体混合液前，用无血清培养液充分洗涤待转染细胞很重要，因为血清会强力抑制转染；有些胞外基质复合物，如硫酸蛋白聚糖，也可抑制转染。
(4)GFP 表达的影响因素主要与转染时的温度、pH 值和观察时间有关。同一表达载体转染同一种细胞后，分别在 33 ℃ 和 37 ℃ 条件下培养，则 33 ℃ 条件下培养者可观察到较强的荧光，而 37 ℃ 条件下培养者荧光较弱，其原因可能是 37 ℃ 时三肽环状结构不易形成。培养液的 pH 值也显著影响 GFP 的荧光特性，转染后的细胞于 33 ℃、5% CO2 条件下培养，在培养液为碱性时荧光较强，培养液为酸性时荧光减弱。荧光强度一般在转染后 48 h 最强，这可能是一方面与 GFP 的表达量有关，另一方面与细胞的生长状态有关。因此，在实验中应严格控制转染时的温度、pH 值和观察时间，以获得较好的实验结果。
来源：丁香实验
