🔥 磷酸钙转染法

运用物理或化学方法将外源 DNA 导入细胞的过程，称为 DNA 转染或基因转染（transfection）。采用该技术，既可将外源基因导入体外生长的细胞，用于研究基因的表达调控，亦可将外源基因导入体内细胞，用于基因治疗。磷酸钙转染法操作简单，无需昂贵的仪器设备，成本较低，已被许多实验室广泛采用。

磷酸钙转染法的原理是在 pH = 7.1 环境中，DNA 分子带负电荷，在静电引力的作用下，带正电荷的粒子可与 PO 结合。当在溶液中加入 CaCl₂ 时，PO^- 与 Ca2⁺ 形成磷酸钙，并与 DNA 共沉淀。待转染细胞可吞噬这些 DNA 沉淀，从而使 DNA 进入转染细胞中。

器材： 

① 1.5 ml Eppendorf 管

② 20 μl 微量移液器

③ 100 μl 微量移液器

④ 2 ml 移液器

⑤ 吸头、吸管

⑥ CO₂ 培养箱

⑦ 倒置显微镜

⑧ 荧光显微镜（450~490 nm）

试剂：

① 细胞

② 2×HEPES 溶液

③ 2.0 mol/L CaCl₂ 溶液

④ 0.25% 胰蛋白酶

⑤ PBS 溶液（pH = 7.05）

⑥ 超纯水

⑦ 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养液

⑧ 0.1×TE（pH = 8.0）稀释的 pCMV-GFP 质粒 DNA（0.5~1 μg/μl）

磷酸钙转染法的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）0.1×TE 缓冲液（pH 8.0）：1.0 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；0.1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。

（2）2×HEPES（pH = 7.05）：HEPES，5.96 g；NaCl，8.00 g；KCl，0.37 g；Na₂HPO₄，0.106 g；葡萄糖，1.00 g。加入超纯水 480 ml，精调 pH 至 7.05，定容至 500 ml，再测定 pH 并调准。用 0.22 μm 滤器过滤除菌后储存于 4 ℃ 备用。

（3）2.0 mol/L CaCl₂：称取 10.8 g CaCl₂·6H₂O 溶于 20 ml 超纯水中，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，分装成 1.0 ml 小份，-20 ℃ 保存备用。

（4）含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养基：DMEM 培养基，补加 10% 小牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/L 链霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.3 mmol/L 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷、0.1 mmol/L 甘氨酸和脯氨酸，pH = 7.2。

（二）转染过程

（1）于转染前 24 h，用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化细胞。将 1×10⁶ 个细胞转接于 60 ml 培养皿中，加 4 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养液，置 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

（2）转染前，取出培养液在倒置显微镜下观察，待细胞生长至 60%~70% 皿底面积时，挑取生长旺盛、细胞间有少量空隙的培养瓶，倒掉培养液，用 4 ml PBS 洗 2 次，待用。

（3）DNA 沉淀液的准备。首先将 pCMV-GFP 质粒 DNA 溶解在 0.1×TE（pH = 8.0）中，使浓度为 0.5~1.0 μg/μl。

在 Eppendorf 管中依次加入重蒸水 427.5 μl、pCMV-GFP 质粒 DNA 稀释液 10 μl，充分混匀，强烈振荡下加入 500 μl 的 2×HEPES 溶液，最后缓慢滴加 2.0 mol/L CaCl₂ 62.5 μl（加入 CaCl₂ 时应尽量缓慢，并不断轻轻敲击试管，以防形成结块）。

（4）于室温下放置 5 min，出现轻度浑浊，20~30 min 时，缓慢形成细微的沉淀颗粒（沉淀粗大会影响细胞的吞噬作用，导致转染失败）。

（5）将形成的 1.0 ml 沉淀物加到用 PBS 洗过 2 次的培养瓶内的细胞表面，于室温下放置 10 min，然后再于 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 min，其间不断倾斜培养皿。

（6）然后，倒掉沉淀物，加入新的完全培养液，继续在 CO₂ 培养箱中孵育 1~2 d。

（7）24 h 后。在 450~490 nm 波长的光下用荧光显微镜观察细胞的转染率和荧光强度。

（8）记录、分析实验结果。

（1）该法对质粒 DNA 的质量要求极高，质粒溶液中不能含有杂蛋白及 RNA。

（2）要制备出高效转染的磷酸钙-DNA 共沉物非常困难，其共沉物的粗细大小与转染效率的高低密切相关，通常以形成细密的沉淀为好。

影响 DNA 沉淀形成的因素，除质粒 DNA 的纯度外，还与盐离子浓度、HEPES 缓冲液的 pH 值、反应温度、反应时间等因素关系很大，尤其是 HEPES 缓冲液的 pH 值必须严格限定在 7.05±0.05。