电穿孔转染法

运用物理或化学方法将外源 DNA 导入细胞的过程，称为 DNA 转染或基因转染(transfection)。采用该技术，既可将外源基因导入体外生长的细胞，用于研究基因的表达调控，亦可将外源基因导入体内细胞，用于基因治疗。电穿孔法转染效率较高，但需要昂贵的仪器。

电穿孔转染法的原理是利用脉冲电场将 DNA 导入培养细胞，当细胞处于较高电压的电场中时，瞬间的电脉冲可将细胞膜穿孔，处于电场中的 DNA 得以进入细胞。常见的电穿孔仪根据其不同放电波形分为两种类型：一种是方波放电，另一种是指数衰减波放电。电穿孔法所需的 DNA 量较少，转染的效率也比较高。由于电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，可广泛应用于各种细胞的转染，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，电穿孔法与用化学物质或病毒法进行转染相比，几乎没有生物或化学副作用。该法的缺点是对设备条件要求较高，而且不同的细胞对电压的高低、电脉冲的长短要求不一样，要达到最佳效果，需要进行预实验加以确定。

器材:

① 1.5 ml Eppendorf 管

② 20 μl 微量移液器

③ 100 μl 微量移液器

④ 2 ml 移液器

⑤ 吸头、吸管、吸水滤纸

⑦ 倒置显微镜

⑧ 荧光显微镜(450~490 nm)

⑨ 离心机、天平

⑩ 高压电击仪(Bio-Rad)、电击池

试剂：

③ 胰蛋白酶溶液

④ 含 10% 小牛血清的 MEM 完全培养液

⑤ PBS 缓冲液(pH7.4)

电穿孔转染法的基本过程可分为如下几步:

(1)于转染前 24 h，用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化细胞。将 1x106 个细胞转接于 60 ml 培养皿中，加 4 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养液，置 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

(2)电穿孔前，在倒置显微镜下挑取对数生长的细胞，倾去培养基，用 PBS 缓冲液洗细胞 2 遍。

(3)加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶，在 37 ℃ 孵育 4 min。

(4)倾去消化液，加入 2 ml PBS 缓冲液终止消化，用吸管将 COS7 细胞吹下。

(5)300 g 离心 5 min。

(6)将细胞重新悬浮于 1 ml PBS 中，细胞记数，1 ml PBS 中含有 1x107 个细胞用于转染。

(8)将 DNA- 细胞混合液移入灭菌的电击池中。

(9)按照预实验的结果，选择合适的电压和脉冲时间，电击细胞(按电击仪的操作程序操作)。

(10)电穿孔后，将 DNA-细胞混合液在室温下放置 10 min，使其损伤恢复。

(11)将 DNA-细胞混合液移至 60 ml 培养皿中，加入 4 ml 含 10% 小牛血清的完全培养基，37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养 24 h。

(12)24 h 后，在 450~490 nm 波长的光下用荧光显微镜观察 COS7 细胞的转染率和荧光强度。

(1)电穿孔法转染不同的细胞，均需进行个别优化，选择合适的电压和脉冲时间,得到最优的转染条件。因为每种细胞的转染条件不同，不能从一种细胞的最优条件类推至其他细胞。

(2)电穿孔时，电压高低和电脉冲的长短对转染效果影响很大。电压太小，细胞膜无变化，DNA 不能进入转染细胞；电压太大，容易损伤细胞。因此，电击时所用的电压和脉冲时间应该通过预实验来决定。预实验的电压和脉冲时间应以 60%~70% 的细胞能存活下来为准。

(3)细胞的生长状态对电击转染的效率影响亦较大，一般以处于对数生长中期的细胞为佳。

(4)电穿孔法所用的 DNA 浓度一般在 10~100 μg/ml 范围内。线形 DNA 的转染效率通常比超螺旋 DNA 高。