基因转染实验(脂质体介导DNA转染法)

脂质体（lipofectin regeant,LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）].它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞 中,是目前条件下最方便的转染 方法之一.转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞.

用LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做：第一,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间（2~24小时）.因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜.

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞.

1、操作步骤[方法一]：

（1） 细胞培养 ：取6孔培养板（或用35mm培养皿）,向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液,37℃CO2培养至40%~60%汇合时（汇合过分,转染后不利筛选细胞）.

（2） 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL,B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR,终量100μL,轻轻混合A、B液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致,应酌情减量）.

（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL不含血清培养液.

（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养.

（5）其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同.

注意：转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响.

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：

（1）以5×105细胞/孔接种6孔板（或35mm培养皿）培养24小时,使其达到50~60%板底面积.

（2）在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA.

②旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转.

③室温下放置5~10分钟,使DNA结合在脂质体上.

（3）弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37℃培养3~5小时.

（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM,继续培养14~24小时,

（5）吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培养24~48小时

（6）用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定.

3、稳定的脂质体转染方法如下：

（1）接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染.

（2）DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前（2）、（3）步骤.

（3）在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培养48小时.

（4）吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使 细胞生长 一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行.