材料与仪器
L8057-Y10细胞 D-PBSA
培养瓶 培养板 F12 FB培养基 G418(Invitrogen) 选择性培养基 电穿孔 电穿孔专用杯 电穿孔仪II 电穿孔仪-II配套的效能扩增器-Plus
培养瓶 培养板 F12 FB培养基 G418(Invitrogen) 选择性培养基 电穿孔 电穿孔专用杯 电穿孔仪II 电穿孔仪-II配套的效能扩增器-Plus
步骤
表达载体与 DNA 制备：
pSVTKGH，线性化 [ Selden et al.，1986]
此载体含有 SV 40 增强子及单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子序列，两者可启动人类生 K 激素（hGH ) 基因表达。hGH 可直接分泌到组织培养基上，可通过放射免疫学分析法直接检测 [ Ravid et al.，1991 ]。
pcDNA3，线性化（Invitrogen )
该表达载体在多克隆位点上游含有人类巨细胞病毒增强子-启动子，下游含多聚腺苷酸信号及牛生长激素（bGH ) 基因的转录终止序列。pcDNA3 载体还含有新霉素抗药基因，用作筛选稳定表达目的基因的抗性克隆。如本章方法中所述，pcDNA3 也可用作与报告基因载体共转染的筛选标记。
1. 以 5X105个/ml 的浓度在 75 cm2 培养瓶中接种 L8057-Y10 细胞（F12/FB 培养基）（含谷氨酰胺（2 mmol/L )，青霉素（50 U/ml ) 及链霉素（5 μg/ml ) 的 Ham’s F12 , 添加 10% FBS (热灭活；GIBCO #16140-014)），并于 37°C，5% CO2 孵箱培养细胞。
2. 在对数生长后期，收集细胞，4°C ，380 g 离心 5 min。
3. 用 10ml D-PBSA 洗涤细胞沉淀，4°C，380 g 离心 5 min。
4. 用 5 ml 电穿孔缓冲液洗涤细胞沉淀，用血细胞计数仪计数细胞。
5. 4°C，380 g 再次离心 5 min，收集细胞。
6. 用电穿孔缓冲液将细胞制成密度为 1X106 个/0.8 ml 的细胞悬液。
7. 将 0.8 ml 的细胞移至预冷的电穿孔杯中。
8. 分别加入 50 μg 和 5 μg 线性 pSVTKGH 及线性 pcDNA3 （如果实验目的是检测特异基因启动子-报告基因表达，还需另设无质粒 DNA 的电穿孔细胞，作为阴性对照）
9. 一只手紧握电穿孔杯，另一只手轻弹底部，以混匀 DNA-细胞悬液，将悬液于冰上孵育 10 min。
10. 在 400V /500 μF 条件下轰击细胞悬液，并记录时间。
11. 之后，取出电穿孔杯，在冰上搁置 10 min。
12. 将轰击后的细胞移至盛有 10 ml F12/FB 的离心管中，另取少许培养基冲洗电穿孔杯，移回到离心管，离心，收集细胞。
13. 将细胞于 20 m l F12/FB 中再次悬浮，种到 75 cm2 培养瓶中，于37°C ，5 %CO2 培养箱中孵育，令新霉素抗性基因表达。
14. 24~48 h 后，离心收集细胞，然后用 20 ml 选择性培养基中再次悬浮细胞。
15. 随后，需每 2~4 天换液（选择性培养基），以清除死亡细胞的碎片，并且使抗性细胞生长，筛选过程至少需要两周。
16. 测定 hGH 在细胞上清液的表达（见 27. 11.5 节）。
pSVTKGH，线性化 [ Selden et al.，1986]
此载体含有 SV 40 增强子及单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子序列，两者可启动人类生 K 激素（hGH ) 基因表达。hGH 可直接分泌到组织培养基上，可通过放射免疫学分析法直接检测 [ Ravid et al.，1991 ]。
pcDNA3，线性化（Invitrogen )
该表达载体在多克隆位点上游含有人类巨细胞病毒增强子-启动子，下游含多聚腺苷酸信号及牛生长激素（bGH ) 基因的转录终止序列。pcDNA3 载体还含有新霉素抗药基因，用作筛选稳定表达目的基因的抗性克隆。如本章方法中所述，pcDNA3 也可用作与报告基因载体共转染的筛选标记。
1. 以 5X105个/ml 的浓度在 75 cm2 培养瓶中接种 L8057-Y10 细胞（F12/FB 培养基）（含谷氨酰胺（2 mmol/L )，青霉素（50 U/ml ) 及链霉素（5 μg/ml ) 的 Ham’s F12 , 添加 10% FBS (热灭活；GIBCO #16140-014)），并于 37°C，5% CO2 孵箱培养细胞。
2. 在对数生长后期，收集细胞，4°C ，380 g 离心 5 min。
3. 用 10ml D-PBSA 洗涤细胞沉淀，4°C，380 g 离心 5 min。
4. 用 5 ml 电穿孔缓冲液洗涤细胞沉淀，用血细胞计数仪计数细胞。
5. 4°C，380 g 再次离心 5 min，收集细胞。
6. 用电穿孔缓冲液将细胞制成密度为 1X106 个/0.8 ml 的细胞悬液。
7. 将 0.8 ml 的细胞移至预冷的电穿孔杯中。
8. 分别加入 50 μg 和 5 μg 线性 pSVTKGH 及线性 pcDNA3 （如果实验目的是检测特异基因启动子-报告基因表达，还需另设无质粒 DNA 的电穿孔细胞，作为阴性对照）
9. 一只手紧握电穿孔杯，另一只手轻弹底部，以混匀 DNA-细胞悬液，将悬液于冰上孵育 10 min。
10. 在 400V /500 μF 条件下轰击细胞悬液，并记录时间。
11. 之后，取出电穿孔杯，在冰上搁置 10 min。
12. 将轰击后的细胞移至盛有 10 ml F12/FB 的离心管中，另取少许培养基冲洗电穿孔杯，移回到离心管，离心，收集细胞。
13. 将细胞于 20 m l F12/FB 中再次悬浮，种到 75 cm2 培养瓶中，于37°C ，5 %CO2 培养箱中孵育，令新霉素抗性基因表达。
14. 24~48 h 后，离心收集细胞，然后用 20 ml 选择性培养基中再次悬浮细胞。
15. 随后，需每 2~4 天换液（选择性培养基），以清除死亡细胞的碎片，并且使抗性细胞生长，筛选过程至少需要两周。
16. 测定 hGH 在细胞上清液的表达（见 27. 11.5 节）。
来源：丁香实验
