🔥 流式细胞术检测细胞周期

流式细胞周期检测是一种常见的检测细胞增殖情况的方法，细胞在不同周期时，其内的 DNA 含量不同。碘化丙啶（PI）作为一种核酸嵌入型染料，能够进入固定后的细胞中，与细胞内的核酸结合，其荧光强度与 DNA 含量成正比。

通过流式细胞仪检测不同细胞中的荧光强度，从而判定不同组别中细胞周期发生的变化。

检测不同组别或处理对某种细胞周期的改变。

【器材】流式细胞仪、移液器、枪头、离心管、离心机、水浴锅、流式管、滤头；
【试剂】0.25％ 胰蛋白酶溶液、PBS、RNA 酶、PI 染液、70％ 乙醇溶液（建议提前放入负二十度预冷）；

以肿瘤细胞为例：

• 将正常生长的对照或处理组肿瘤细胞计数，每组取 2×10⁵-3×10⁵ 个细胞铺板，待细胞贴壁后，将正常培养基替换为无血清 1640 培养基，同步 20 h，使得所有细胞都进入相同的细胞周期时期；同步完后，将培养基重新替换为正常含血清培养基，继续培养 24 h；
• 用不含 EDTA 的胰酶将细胞消化，收集细胞，300g，离心 3 min；用吸引器去除培养基，用 PBS 清洗细胞一次，再次300g，离心 3 min；去除 PBS，用提前预冷的 70% 酒精重悬细胞沉淀，4℃ 固定过夜；
• 4℃，1000g，离心 3-5 min，去除酒精，用 PBS 清洗 3 遍，最后一遍去除 PBS；加入 300 μL PBS，轻轻吹打，重悬细胞沉淀，加入相应量的 Rnase 至终浓度 100 μg/mL，37 ℃ 水浴锅中消化 30 min；
• 上机前加入 PI（5 mg/mL）至终浓度 50 μg/mL，避光孵育 15 min；孵育完后，过 300 目细胞筛，上机检测；
• 分析数据。

• PI 为致癌物质，避免用手直接接触。
• 细胞数目应该达到 2x10⁴个，细胞数目过少影响实验结果的准确性。
• 铺板的细胞数量以收获细胞时有足够的生长空间来动态调节，现在的流式细胞仪灵敏度很高，不需要太多的细胞。
• 在制备时，要特别注意清洗过程中细胞的损失。离心次数不宜过多，防止细胞丢失。
• 可以用未处理的细胞调试流式细胞仪。
• 胰酶不加 EDTA。

Q: 酒精固定后细胞难以沉淀下来，导致细胞丢失较多；

A: 可适当延长离心时间和转速。