原理
<link />
材料与仪器
步骤
1. 恒冷切片或石蜡切片，厚 4～6 μm，常规处理。
2. 0.1％NaN3+0.3％H2O2/TBS（50 mmol/L，pH 7.8）或 0.3％H2O2/甲醇，室温 20 min（阻断内源性过氧化物酶活性）。
3. TBS 洗 5～10 min×3。
4. 一抗 CK20（McAb）1:100，4℃，过夜。
5. TBS 洗 5 min×3。
6. EnVision-HRP（羊抗鼠）试剂，室温 30 min。
7. TBS 洗 5 min×3。
8. 正常鼠血清 1:10，室温 15 min（封闭前重标记一抗的游离位点）。
9. TBS 洗 5 min×3。
10. 第二种特异性一抗 Ki-67（McAb）1:100，37℃ 孵育 120 min，TBS 洗 5 min×3。
11. 生物素化羊抗鼠 IgG1:400，37℃ 孵育 30 min。
12. TBS 洗 5 min×3。
13. 链霉亲和素-AKP 1:400，37℃ 孵育 30 min。
14. TBS 洗 5 min×3。
15. 碱性磷酸酶底物显色：NBT/BCIP，阳性产物呈紫蓝色。
16. 聚合物连接的辣根过氧化物酶底物显色（EnVision-HRP）：3-氨基-9-乙基卡巴唑/过氧化氢（AEC/H2O2），阳性产物呈红色。
17. 洗涤后，10％ 缓冲甘油或明胶甘油封片。
18. 光学显微镜观察。
<link />注意事项
为了缩短操作流程，减少脱片率，有学者建议采用不同类别或亚型单克隆抗体混合使用，也同样可获得良好的双标染色结果。<link />
常见问题
<link />
来源：丁香实验
