免疫荧光双重标记TRITC-FITC(间接法)

1. 石蜡切片（贴片前的载玻片应预涂不含有荧光色素的黏片剂），厚 5 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，人 PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）。

2. 1％ 人血清白蛋白（HSA）孵育 10 min（亦可用 10％ 正常羊血清代之），不洗。

3. 抗 ACTH 血清（McAb）1:200，孵育 30 min，37℃，湿盒。

4. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4，内含 1％ Triton X-100，下同）洗，10 min×3。

5. 羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温避光反应 1 h。

6. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3（第一重 ACTH-TRITC 标记染色已完成）。

7. 切片逐级乙醇脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在 80℃ 烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定 2～4 h，使第一重染色中二抗的不饱和抗原结合部位（Fab）失活。

8. 切片以 TBS 洗 5 min×4。

9. 1％ HSA（或 10％ 正羊血清）孵育 30 min，室温，湿盒，不洗。

10. 抗 GH 血清（McAb）1:400，孵育 30 min，37℃，湿盒。

11. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3。

12. 羊抗鼠 IgG-FITC 1:100，湿盒，室温避光反应 1 h。

13. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3（第二重 GH-FITC 标记染色完成）。

14. 缓冲甘油封片。荧光显微镜下分别以 546 nm 及 490 nm 波长的激发光观察切片组织内 TRITC 及 FITC 所标示的 ACTH 及 GH 抗原（TRITC-ACTH 阳性细胞呈红色，FITC-GH 阳性细胞呈亮绿色）。

15. 观察及摄影。用彩色底片对切片同一部位用 546 nm 及 490 nm 波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的 ACTH 与 GH 两种抗原。