Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 568（间接法）双重免疫荧光染色

1. 古兹菲德-雅各氏病（CJD）病人的尸解脑组织，4％ 中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚 5 μm（贴片前的载玻片应预涂不含有荧光色素的黏合剂）。

2. 常规脱蜡，水化。

3. 抗原修复（柠槺酸盐缓冲液 pH 6.0 中，高压灭菌器加热 100℃，20 min）及 96％ 甲酸孵育 2 min，PBS（pH 7.4，0.01mol/L）洗。

4. 滴加一抗（抗 PrP McAb 12F10），1:300，室温，60 min。

5. PBS 洗 5 min×2。

6. 滴加荧光素标记的羊抗鼠 IgG（Alexa Fluor 488-GAM IgG）1:200，室温 30 min。

7. PBS 洗 5 min×2。

8. 正鼠血清封闭（1:10，室温 30 min），PBS 洗。

9. 滴加配对一抗（SMI-31 McAb 1:2500；SMI-32 McAb 1:100；AP20McAb 1:250；SY-38McAb 1:10；抗-突触蛋白 1PcAb 1:25；M12.13 McAb1:25；抗-GFAPPcAb1:2000；CR3/43 McAb 1:50 及抗-泛素 PcAb 1:100 等），室温，60 min。

10. PBS 洗 5 min×2。

11. 滴加荧光素标记的羊抗鼠或羊抗兔 IgG（AlexaFluor568-GAM 或-GARIgG）1:200，室温 30 min。

12. PBS 洗 5 min×2。

13. 10％ 缓冲甘油或明胶甘油封片。

14. 荧光显微镜观察，显影（滤色片分别为 488 nm 及 568 nm）。结果：第一重抗原（PrPTSE）阳性产物呈亮绿色荧光，第二重配对抗原阳性产物呈橘红色。