免疫纳米金与免疫酶结合的双重染色

按以下步骤进行免疫染色：

1. 含1%正常血清或1%BSA的PBS预孵育20～30分钟；

2. 两种特异性第一抗体(免疫自不同种属动物)的混合物4℃下孵育24～48小时；PBS漂洗3次，每次10分钟；

3. 与第一抗体种属相应的纳米金标记的IgGFab，片段和生物素标记的第二抗体的混合物室温孵育2小时或4℃下孵育12小时后PBS漂洗3次，每次10分钟；

4. ABC(1：100，Vector)室温孵育2小时后PBS漂洗3次，每次10分钟。之后PBS漂洗2次，每次10分钟；

5. 4℃下银加强漂洗缓冲液漂洗2次，每次10分钟；

6. 4℃下银加强10～15分钟(避光)；

7. 4℃下定影液中定影10分钟后PB漂洗2次，每次10分钟，并用0.05mol/L Tris―HCl(pH 7.6)漂洗2次．每次10分钟；

8. 0.03%――0.05%DAB 0.01%HCL 0.05mol/LTns―HCl(pH 7.6) 显色10～15分钟；

9. 0.05mol/L Trls―HCl(pH7.6)漂洗2次，每次10分钟，接着以PB漂洗2次，每次10分钟；

10. PB配制的1%戊二醛固定30分钟～2小时后PB漂洗2次，每次10分钟。

按常规电镜标本制作方法进行锇酸后固定、系列乙醇或丙酮脱水、包埋、超薄切片、电子染色和电镜观察。

免疫纳米金与免疫 酶结台的双重染色法电镜图

环氧树脂包埋前免疫纳米金与免疫酶结合的双重染色示大鼠脊髓背角浅层内第7型代谢型谷氨酸受体（mGluR7）和凝集素I―B4结合位点免疫纳之(金染邑标记的mGluR7特异性定位于突触前膜二(箭所示)：免疫酶染色标记的凝集素I―B4结合位．点分布在轴突终末内(弥散的高电子密度反应产物)Al，标记的轴突终末：A2。未标记的轴突终末；Dl和D2，树突)