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基于RNA结合蛋白免疫沉淀分析lncRNA

相关实验:长链非编码RNA的研究策略及技术

最新修订时间:

简介

大量研究表明,lncRNA能够通过募集染色质修饰复合体到基因启动子区,并通过改变染色质的状态来影响基因的转录和表达水平。此外,lncRNA还能够与转录因子结合形成核糖核蛋白复合体,进而调控这些转录因子的活性。因此,掌握lncRNA与蛋白相互作用的研究方法对于探索lncRNA的生物学功能有着非常重要的意义。

原理


基于RNA结合蛋白免疫沉淀分析lncRNA的基本原理是:在生理状态下,针对可以结合RNA的蛋白质进行免疫沉淀,然后分离抗体-蛋白A/G-琼脂糖珠复合物中的RNA成分,最后通过基因芯片或其他手段来检测目的RNA。

用途

RNA结合蛋白免疫沉淀实验主要用于检测与感兴趣的某种蛋白相结合的那些RNA。

材料与仪器

器材:


离心机;水浴锅。


试剂:


①PBS(DEPC水配制);
②核糖体裂解液 ;
③蛋白酶抑制;
④DTT;
⑤RNase抑制剂;
⑥Ribonucleoside Vanadyl Complexes;
⑦NT2缓冲液(含5% BSA);
⑧TEV蛋白酶反应液;
⑨TEV酶;
⑩Trizol氯仿;
⑪异丙醇;
⑫醋酸铵;
⑬MgCl2
⑭糖原

步骤

基于RNA结合蛋白免疫沉淀分析lncRNA的基本过程可分为如下几步:


A. 以两个10 cm培养皿为例:转染细胞48 h后,用预冷PBS(DEPC水配制)洗1次,每10 cm培养皿加2 ml胰酶消化细胞5-10 min,4 ml含血清培养基终止消化。


B. 将2个培养皿的细胞分别收集到15 ml离心管中,1000 r/min离心5 min。


C. 以下操作均在RNA工作台完成:去上清,1 ml预冷PBS(DEPC水配制)洗2遍,1000 r/min离心5 min。


D. 配制1 ml核糖体裂解液,加入PMSF、pep、leu、Apro 4种蛋白酶抑制剂各20 µl,100 mmol/L DTT 10 µl,RNase抑制剂2 µL(40 U/µI)以及Ribonucleoside Vanadyl Complexes 2 µl(200 mmol/L)。


E. 向每个大培养皿收集来的细胞中加入450µl裂解液,冰上放置45 min。


F. 准备两个1.5 ml EP管,各加入150 µl链亲和素珠,充分混匀至管底无珠子沉淀后重悬于10倍珠子体积的NT2缓冲液(含5% BSA)中,4 ℃摇床孵育30 min。


G. 配制8 ml NT2缓冲液(含25 mmol/L EDTA,2 mmol/L DTT,100 U/ml RNA酶抑制剂,400 µmol/L VCR以及4种蛋白酶抑制剂),平均分入2个15 ml离心管中。


H. 步骤E细胞裂解完毕后,4 °C、12000 r/min离心25 min,各取上清400 µl移至步骤G所准备的4 ml NT2缓冲液中,混匀(可适当留12 µl左右上清做Western印迹检测用)。


I. 珠子30 min孵育完毕后,4 °C、1500 r/min离心3 min,去上清,10倍体积NT2缓冲液洗珠子3次,每次洗完后于4 °C、1500 r/min离心3 min。


J. 用NT2缓冲液将珠子重悬,加入到步骤H制备的含细胞裂解上清的NT2缓冲液中,4 °C摇床过夜。


K. 4 °C、1500 r/min离心3 min,去上清,1 ml NT2缓冲液重悬并转移至1.5 ml EP管中,10倍体积冰预冷的NT2缓冲液洗5遍。


L. 用含1 mol/L尿素的NT2缓冲液洗2遍,4 °C、1500 r/min离心3 min。


M. 配制TEV蛋白酶反应液500 µl:20 µlTEV酶,50 µl 10xTEV缓冲液,DEPC水430 µl,各取250 µl重悬珠子,室温颠倒消化反应3 h,4 °C、1500 r/min离心3 min。


N. 直接在TEV蛋白酶反应液中加350 µl蛋白酶K消化缓冲液(2X)及7µl蛋白酶K(200 mg/ml),55 °C水浴6 min,5次,每次颠倒混匀10 s,4 °C、1500 r/min离心3 min。


O. 每管吸取上清约600 µl,分为3管后向每管200 µl上清中加入800 µl Trizol和200 µl氯仿,剧烈振荡30 s,4 °C、12000 r/min离心20 min。


P. 每管吸取上清约600-700 µl,加入0.8倍体积异丙醇、0.1倍体积5 mol/L醋酸铵、4.5 µl 500 mmol/L MgCl2以及2 µl糖原(20 mg/ml),混匀后-80 °C过夜。


Q. 4 °C、12000 r/min离心15 min沉淀总RNA,进行后续检测。

来源:丁香实验

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