基于转录组深度测序分析lncRNA

转录组深度测序，也称循环芯片测序、第二代测序技术，即对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行的一系列延伸反应和荧光序列读取反应，通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号。该类测序方法采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，阵列上的DNA样本可以被同时并行分析。

基于转录组深度测序分析lncRNA的基本原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待测序列模板上的引物，直到在新合成DNA链的3'-端掺入一种2'，3'­双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP脱氧核糖的3'-位碳原子上缺少羟基而不能与下一位核苷酸的5'-位磷酸基之间形成3'，5'-磷酸二酯键，从而使得正在延伸的DNA链在此ddNTP处终止。

因此通过在4种反应体系中分别加入4种不同的ddNTP底物，就可得到终止于特定碱基的一系列寡核苷酸片段。这些片段具有共同的起点（即引物的5'-端），而有不同的终点（即ddNTP掺入的位置），其长度取决于ddNTP掺入的位置与引物5'-端之间的距离。

经可分辨1个核苷酸差别的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，进而借助片段中的所带标记（如核素标记）即可读出一段DNA序列。

第二代测序技术的用途十分广泛，可用于细致地分析基因组和转录组全貌，因此又被称为深度测序(deep sequencing)。

例如：

①可用于尚无序列物种的全基因组从头测序，从而获得该物种的参考序列，为后续研究奠定基础；

②可用于有参考序列物种的全基因组重测序，从而在全基因组水平上扫描突变位点，揭示个体差异的分子基础；

③可用于全转录组测序，从而分析可变剪接、编码序列的单核苷酸多态性等；

④可用于小分子RNA测序，从而发现新的小RNA分子；

⑤可与染色质免疫共沉淀技术相结合，从而鉴定出与特定转录因子结合的DNA区域；

⑥可与甲基化DNA免疫共沉淀技术相结合，从而鉴定出基因组上的甲基化位点。

基于转录组深度测序分析lncRNA的基本过程可分为如下几步：

①将基因组DNA随机分割成小片段DNA分子，获得DNA文库片段。

②在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库。

③将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面（平面或微球的表面）。

④通过对固定片段进行克隆扩增，从而制成PCR集落（PCR colony or polony）芯片。每一个集落中都含有1个小片段DNA分子的多个拷贝。许多这样的集落集合在一起就形成了集落芯片。这样一次测序反应就可以同时对众多的集落进行测序。克隆扩增方式包括桥式PCR、乳液PCR或原位成簇。

⑤针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环的反应操作，通过读取将碱基连接到DNA链上的过程中释放出的光学信号（荧光或化学发光）而间接确定碱基序列。

然后，对产生的阵列图像进行时序分析，便可获得DNA片段的序列。最后，按照一定的计算机算法将这些片段组装成更长的重叠群。