长链非编码RNA的研究策略及技术

免疫学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度大于200个核苷酸但不编码蛋白质的RNA转录本。lncRNA种类众多，研究表明，小鼠的转录组中共包含大约18万种转录本，其中具有蛋白编码能力的转录本仅有2万余种，而在剩下的16万种中，除了少部分是小RNA之外，绝大多数都是lncRNA。

长链非编码RNA可通过多种机制发挥广泛而重要的生物学功能，比如影响基因转录、引起染色质重塑、参与细胞周期调控、RNA剪接调控、翻译调控、mRNA降解等。

目前用于lncRNA研究的主要方法有 7 种：

基于微阵列芯片检测lncRNA、基于转录组深度测序分析lncRNA、基于 Northern印迹鉴定特定mRNA、基于实时定量PCR分析lncRNA、基于原位杂交法检测miRNA、基于RNA结合蛋白免疫沉淀分析lncRNA以及基于RNA纯化的染色质分离技术分析lncRNA等。

原理

根据实验方法不同，对应的原理也有所不同：

基于微阵列芯片检测lncRNA的基本原理是基于探针杂交检测lncRNA，随后对lncRNA进行标记，主要采用酶法标记或化学标记，标记物可用生物素或荧光素。

基于转录组深度测序分析lncRNA的基本原理是是提取总RNA，给所有的转录产物分别连上3'-RNA和5'-RNA接头，然后进行RT-PCR扩增，并通过纯化得到小RNA文库以用于高通量测序，最后通过与lncRNA数据库以及参考基因组比对来分析lncRNA的表达清况。

基于 Northern印迹鉴定特定mRNA的基本原理是是通过凝胶电泳使完全变性的RNA按大小分离，然后利用印迹技术将RNA分子转移到固相支持物上，固定后再采用特异性的探针进行杂交来鉴定其中特定mRNA分子的量与大小。

基于实时定量PCR分析lncRNA的基本原理是依靠荧光标记物和自动化仪器，每次循环都可读出荧光强度，实时监测了反应进程中的PCR产物，从而更精确地实现了对lncRNA定量及定性分析。

基于荧光原位杂交检测lncRNA的基本原理是是以已知序列核酸作为特异性探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测。

基于RNA结合蛋白免疫沉淀分析lncRNA的基本原理是在生理状态下，针对可以结合 RNA 的蛋白质进行免疫沉淀，然后分离抗体－蛋白A/G-琼脂糖珠复合物中的RNA成分，最后通过基因芯片或其他手段来检测目的RNA。

基于RNA纯化的染色质分离技术分析lncRNA的基本原理如下：首先以戊二醛固定细胞，使lncRNA与染色质的相互作用得以稳定维持，然后进行细胞裂解和超声破碎，接着用生物素标记的寡核苷酸探针与靶lncRNA杂交。

随后基于生物素和链亲和素相互作用的原理，采用链亲和素磁珠来分离纯化lncRNA染色质复合体，最后从纯化的RNA-染色质复合体中分离蛋白质、DNA或RNA,以进行后续的各种分析。

来源：丁香实验团队

操作方法

基于转录组深度测序分析lncRNA

转录组深度测序，也称循环芯片测序、第二代测序技术，即对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行的一系列延伸反应和荧光序列读取反应，通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号。该类测序方法采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，阵列上的DNA样本可以被同时并行分析。

基于 Northern印迹鉴定特定mRNA

Northem印迹杂交是1977年，StarkGR建立的，与Southern印迹杂交相对应称为Northern印迹(Northern blotting)杂交。

基于实时定量PCR分析lncRNA

实时定量PCR依靠荧光标记物和自动化仪器，每次循环都可读出荧光强度，实时监测了反应进程中的PCR产物，从而更精确地实现了对模板样品的定量及定性的分析。

基于原位杂交法检测miRNA

荧光原位杂交原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法。

基于RNA结合蛋白免疫沉淀分析lncRNA

大量研究表明，lncRNA能够通过募集染色质修饰复合体到基因启动子区，并通过改变染色质的状态来影响基因的转录和表达水平。此外，lncRNA还能够与转录因子结合形成核糖核蛋白复合体，进而调控这些转录因子的活性。因此，掌握lncRNA与蛋白相互作用的研究方法对于探索lncRNA的生物学功能有着非常重要的意义。