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长链非编码 RNA(lncRNA)研究策略

武汉金开瑞

20977

长链非编码 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)指的是转录本长度在 200-100000 nt 之间的 RNA 分子,它们不编码蛋白,位于细胞核或胞质内,具有保守的二级结构。

研究显示,lncRNA 并非以前所认识的那样没有功能,它可与蛋白质、DNA 和 RNA 相互作用,通过多种机制(如基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等)在多种层面上(如表观遗传学、转录调控及转录后调控等)调控基因的表达水平。

lncRNA 参与多种生物学调控,在生命活动中发挥着重要的作用。随着近些年来 lncRNA 相关论文发表量的成倍增加,该领域关注度也日益增高,已成为继信使 RNA(mRNA)、小 RNA(microRNA、siRNA 等)之后功能基因组学最火热的研究领域。

LncRNA 的经典研究思路如下:

现在很多人拿到测序结果或者芯片结果之后,无从下手。具体可以从以下几个步骤着手:

第一步 确定差异lncRNA表达

利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 检测 lncRNA 在不同细胞或者组织中的表达水平。

第二步 探究 lncRNA 特点

(1)通过 QD-FISH 原位杂交技术定位;或者通过细胞核质分离试剂盒得到 RNA,qRT-PCR 检测其分布;
(2)全长序列试验方法:通过 5′RACE 获取 lncRNA5′ 全长, 3′RACE 获取 lncRNA3′ 全长,最终得到 lncRNA 完整的全长序列。

第三步lncRNA的功能研究

lncRNA 较长,承载的信息量多,更容易形成高级结构,其功能具有多样化和特异性强的特点。类似于 miRNA,探讨 lncRNA 功能可用 gain/loss of function 策略,过表达或沉默 lncRNA 后观察表型。即研究 lncRNA 功能获得后或者功能缺失后对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移与克隆形成,以及病毒的转录复制等的影响。

(1)功能获得性研究

构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长 lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA 很大或全长尚未分离,这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA 表达质粒时,需关注 lncRNA 是否在蛋白编码基因的启动子区域或 3′-UTR 区域,勿遗漏重要区段。

(2)功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反义核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA,经 qRT-PCR 或 FISH 等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。

第四步 机制研究

lncRNA 可与蛋白质、DNA 和 RNA 相互作用,但是目前最常用的还是利用体外转录、RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、CHIRP-seq(Chromatin isolation by RNA Purification)、MS 等技术手段。

小知识:

RNA pull down 技术是检测 RNA 结合蛋白与其靶 RNA 之间相互作用的重要实验手段。利用体外转录法标记生物素 RNA 探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过 Western Blot 实验检测特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 相互作用。

RNA-RIP 技术是一种高通量检测细胞内 RNA 与蛋白结合情况的技术,运用针对目标蛋白的抗体把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的 RNA 进行分析。RIP 技术下游结合 microarray 技术(被称为「RIP-Chip」)帮助我们更高通量地了解癌症以及其他疾病整体水平的 RNA 变化。

CHIRP-Seq 是一种检测与 RNA 绑定的 DNA 和蛋白的高通量测序方法。采用生物素和链霉亲和素探针把目标 RNA 拉下来后,则与其共同作用的 DNA 染色体片段就会附在磁珠上,最后把染色体片段做高通量测序,就会得到该RNA能够结合在基因组的哪些区域;如果结合物是蛋白质,可以将蛋白质打断成肽段进行质谱鉴定。

第五步 表达调控

将 lncRNA 表达与其他领域相结合,解释其调控机理。(1)DNA 甲基化和乙酰化:可通过检测相应基因甲基化、乙酰化差异与 lncRNA 结合分析。(2)转录因子:研究 lncRNA 与转录因子的调控机制。

第六步 体内验证

有条件的实验室,可以继续在体内或者临床样本水平进行验证。

lncRNA的作用机制不清楚,lncRNA 的功能非常难研究。当前很多通过研究 miRNA 与 lncRNA 的调控关系来揭示非编码 RNA 的功能,最热门的要数 ceRNA 调控网络。相关的可利用资源包括:

(1)starBase 平台构建了最全面的 CLIP-Seq 实验支持的 miRNA 和 lncRNA 的调控关系网络,包括构建了 ceRNA 调控网络
(2)
DIANA-LncBase 数据库 只是构建了基于单个 CLIP-Seq 数据的 miRNA 和 lncRNA 调控关系。

做完以上步骤,差不多就是一篇不错的 SCI 论文了,找到互作蛋白后,可以再研究信号通路以及相关机制,更加丰富完善论文,档次就更高了。

本文章由
武汉金开瑞生物工程有限公司提供。

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