光镜下双重免疫标记实验
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简介
双重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位标记两种或两种以上抗原-抗体复合物，达到在同一细胞或亚细胞水平显示不同抗原成分（定性、定位、定撤），分析不同抗原成分相互间功能的增消关系，操作遵循的原则与要求同单标免疫组化方法。其组合方法多种多样，可根据各实验室现有试剂进行组合，也可购置较为成熟的商品化试剂盒。另外，二种抗体间的种属和表达部位的搭配也很重要。
常用方法可按标记物分为三种类型。
（1）免疫荧光双重标记
（2）免疫酶双重标记
①单酶双底物：HRP-DAB/H2O2（棕色）与 4-CN/H2O2（蓝色）或镍-钴 DAB，AP-萘酚 AS-MX 磷酸盐/坚固红（红色）与坚固蓝（蓝色）；
②双酶双底物：HRP-DAB/H2O2（棕色）与 AP-萘酚 AS-MX 磷酸盐/坚固蓝（蓝色）等。
（3）混合双重标记如酶标记与荧光素标记配伍；胶体金（银）标记与荧光索标记配伍；胶体金（银）标记与酶标记配伍等。
双重或多重标记方法也可按标记抗体分为直接法、间接法、复合物法、聚合物扩增法等；按抗体制备动物来源分为异种动物抗体法与同种动物抗体法；按制备抗体构型分为单克隆抗体与多克隆抗体混合法、单克隆抗体亚类型混合法（如 IgG 与 IgM 亚类组合、IgG1a 与 lgG2b 亚型组合）等；按有否洗脱去除第一重抗原-抗体复合物分为洗脱法与非洗脱法。
一般多采用荧光或酶标间接法，混合试剂，不洗脱。光镜以双荧光或双底物酶标记为多，颜色区别。
来源：免疫组织化学实验技术及应用
来源：丁香实验
操作方法
1. 石蜡切片（贴片前的载玻片应预涂不含有荧光色素的黏片剂），厚 5 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，人 PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）。2. 1％ 人血清白蛋白（HSA）孵育 10 min（亦可用 10％ 正常羊血清代之），不洗。3. 抗 ACTH 血清（McAb）1:200，孵育 30 min，37℃，湿盒。4. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4，内含 1％ Tri
Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 568（间接法）双重免疫荧光染色1. 古兹菲德-雅各氏病（CJD）病人的尸解脑组织，4％ 中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚 5 μm（贴片前的载玻片应预涂不含有荧光色素的黏合剂）。2. 常规脱蜡，水化。3. 抗原修复（柠槺酸盐缓冲液 pH 6.0 中，高压灭菌器加热 100℃，20 min）及 96％ 甲酸孵育 2 min，PBS（pH 7.4，0.01mol/L）洗。4. 滴加一抗（抗 PrP McAb 12F10），1:
HRP/AP 双酶双底物的双重免疫染色（间接法）——淋巴瘤轻链κ、λ的双重酶标记1. 石蜡切片常规脱蜡至水（若用含汞固定液固定的组织，则需用内含 0.5％ 碘的乙醇溶液脱汞 5 min，乙醇浓度为 70％，经自来水洗后以 2.5％ 硫代硫酸钠浸洗 1 min，水洗）。2. 0.3％H2O2 甲醇液浸泡切片 30 min，自来水洗，蒸馏水洗，入 PBS（0.01mol/L，pH 7.2）洗。3. 滴加正常羊血清 1:10，湿盒，室温，10 min，不洗。4. 加一抗（抗人κPc
改良的 EnVision-HRP/AP 双酶双底物的双重免疫染色（间接法）1. 恒冷切片或石蜡切片，厚 4～6 μm，常规处理。2. 0.1％NaN3+0.3％H2O2/TBS（50 mmol/L，pH 7.8）或 0.3％H2O2/甲醇，室温 20 min（阻断内源性过氧化物酶活性）。3. TBS 洗 5～10 min×3。4. 一抗 CK20（McAb）1:100，4℃，过夜。5. TBS 洗 5 min×3。6. EnVision-HRP（羊抗鼠）试剂，室温 30
